1、 植物组织培养陈勇n一、培养基的成分及作用n二、培养基的制备n概念：本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。即应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。n这项技术已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢产物生产和种质资源的保存等方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。n根芽形成的激素控制理论：根芽形成的激素控制理论：细胞分裂素与生长素的比例与绝对含量，调控着植物组织的形态发生及细胞分化，当比值高时产生芽，低时产生根，比值适中时可能维持原组织生长而不分化。植物组织培养的优点植物组织培养的优点n1.研究材料来源单一，无性系遗传背景一致n2.经济方便效率高n3.条
2、件可控误差小n4.生长快周期短重复性强n5.周年试验或生产n组织培养的几道主要工序：培养器皿的清洗；培养基的配置、分装、包扎和高压灭菌；无菌操作材料的表面灭菌和接种；放入培养室培养；试管苗的种植与初期管理。n操作技术操作技术n1.洗涤洗涤 培养过程中最经常最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂。n2.灭菌灭菌 有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。n（
3、1）培养基的灭菌：）培养基的灭菌：常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体只要121 即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。灭菌的功效主要是靠温度，而不是压力。n高压灭菌锅的使用可选用以下任一种：A.打开放气阀，煮沸15分钟后再关闭；B 打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭；C 先关闭放气阀，待压力上升到0.5kg/cm2 以上时，打开放气阀放出空气，再关闭。n（2）不耐热的物质将采用过滤灭菌）不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。n（3）玻璃器皿及耐热用具
4、等可采用干热灭菌）玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 即利用烘箱加热到160-180 的温度来杀灭微生物。n（4）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌n（5）布制品采用高压灭菌）布制品采用高压灭菌n（6）其它）其它二、培养基的成分及作用二、培养基的成分及作用n完善的培养基配方：包括大量元素、微量元素、铁盐溶液、碳源、有机附加成分、植物激素、琼脂等。n配置中注意8个字：大、微、铁、有、糖、琼、激、PH。n（一）大量元素（一）大量元素 植物所需元素，浓度大于0.5mmol/l的应属于大量元素，而小于0.5mmol/l的则属于微量元素。植物必需的元素在体内的生理作用有四方面
5、（P49）。MS培养基的特点：含有很高量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，还含有一定数量的铵盐。n（二）微量元素（二）微量元素 植物所需的微量元素至少包括铁、硼、锰、锌、钼、铜、钴和氯。微量元素的生理作用主要在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。n（三）铁盐（三）铁盐 现在培养基中几乎都采用FeEDTA形态的铁盐。铁促进细胞分裂与伸长，还影响到叶绿体的结构组成与叶绿素形成。n（四）有机成分（四）有机成分 植物组织需要的一些维生素、氨基酸、肌醇，统称为有机附加成分。维生素有维生素B1（硫胺素）、维生素B6（吡哆醇）、维生素B3或维生素PP（烟酸）、维生素B5（泛酸钙）等 氨基酸中最常
6、用的是甘氨酸。n（五）糖（五）糖 作用：碳源、碳骨架、提供底物与能源、维持一定的渗透势。常用的碳源是蔗糖，浓度为25%。n（六）琼脂（六）琼脂 琼脂是最好的固化剂，本身并不提供任何营养。用量一般在4-10g/l之间。n（七）植物激素（七）植物激素 植物激素是植物新陈代谢中产生的 天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动。常用种类有：n1.生长素类：生理作用（P61），主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-D等。n脱分化：使已分化了的停止分裂的细胞失去分化
7、特性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的能力。n分化阶段：使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构的特化细胞。n2 细胞分裂素细胞分裂素 生理作用：（P63）种类有苄基腺嘌呤（6-BA）、糠基腺嘌（激动素）等。n3 赤霉素（赤霉素（GA）生理作用：（P67）n4 脱落酸（脱落酸（ABA）生理作用：（P68）n5 乙烯乙烯 生理作用：（P69）n（八）（八）PH 值值 PH值即酸碱度 培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般用1N的KOH或NaOH调整到PH5.6-5.8的范围内。n（九）其它成分 较常见的有活性炭、抗生素、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制
8、剂、促进细胞分裂和胚状体同步发生的药剂等。植物组织培养植物组织培养培养基的制备培养基的制备n（一）储备液的配置与保存（一）储备液的配置与保存 将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配一些浓溶液，用时稀释，这种浓溶液就是储备液或母液。一般大量元素比使用液浓度高10-100倍，微量元素等可高200-1000倍。表4-1 MS培养基储备液的配制成分用量（mg/l)每升培养基取用量（ml）储备液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4330003800088007400340050储备液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2O
9、Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O166124044 60172050555储备液3（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O550074605储备液4（有机成分）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸20000100100204005培养基的配制培养基的配制n1.先在洁净的不锈钢锅里放入约750ml 蒸馏水，加入所需要的琼脂（8-10克克）和糖（30克）。n2.加入各种母液(如大量元素100ml，微量元素、有机物、铁盐各10ml），按需要加入植物激素（如2.4-D 20ml、6-BA 5ml）。n3.加蒸馏水将最终体积调整到1l。n4.充分混合好以后，用
10、1NKOH（或NaOH)调整PH值到所需值（5.8左右）。n5.趁热将培养基倒入三角烧瓶中，可通过玻棒引流。n6.包牛皮纸盖并用橡皮筋绑好。n7.高压灭菌后取出。n培养基的灭菌：培养基的灭菌：打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出，5分钟后再关闭放气阀，待压力上升到121度 1.1kg/cm2时，稳压20分钟。然后关闭电源，待压力降为零后，再打开放气阀。配置1升培养基分工：称重：1 琼脂 8-10克；2 蔗糖 30克；3 肌醇 100毫克。母液：1 大量元素 100ml；2 微量元素 10ml；3 有机物质 10ml；配置1升培养基分工：4 铁盐 10ml；5 生长素 2.4-D 20ml；6 6-B
11、A 2ml.配置：75%酒精 500ml准备：培养皿 1副/人；饭盒解剖刀柄 2把；镊子（大、小）各两把；三角烧瓶 50 ml 4个/人；宽口瓶（大、小）各两个裁牛皮纸、酒精棉球培养基的配置及灭菌实验准备用品培养基的配置及灭菌实验准备用品药品：药品：n95%乙醇 1瓶n蔗糖 1瓶n琼脂 1瓶n大量元素（10倍母液）1瓶n微量元素（100倍母液）1瓶n维生素（100倍母液）1瓶nFe盐（100倍母液）1瓶nCa盐（100倍母液）1瓶n2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）1瓶器材：器材：n棉花 1包n橡皮筋 1包nPH试纸（4-7）1包n牛皮纸 1张n蒸馏水 1桶n烧杯（100ml500ml或100
12、0ml）各2个n培养皿（大）8对n三角烧瓶（50ml或100ml）20个n广口瓶（250ml）1个n移液管（10ml）3支n量筒（100ml）1个n镊子（大、中）各1把n解剖刀柄 1把n解剖刀片 1包n剪刀（大）1把n加热杯（1000ml、金属、有刻度）1个n电炉（1000瓦以上）1个n洗瓶 1个n植物组织培养植物组织培养接种和培养接种和培养 接种：把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上。外植体：即接种的植物材料。n材料处理的第一步：刷洗、冲洗。第二步：用洗衣粉水或肥皂 水浸洗并搅动。第三步：超净台内材料的表 面灭菌灭菌剂使用浓度（%）持续时间（分钟）去除的难易效果次氯酸钙次氯酸钠过氧化氢
13、（双氧水）溴水硝酸银氯化汞（升汞）抗菌素9-10210-121-210.1 14-50ppm5-305-305-152-105-302-1530-60易易最易易较难较难中很好很好好很好好最好较好n要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。n次氯酸钙、次氯酸钠氯气n过氧化氢原子态氧n升汞灭菌效果最好，去除较难，需无菌水刷洗8-10次。n95%酒精灼烧表面n不同植物、部位、组织年龄及环境状况灭菌时间不同人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿：洗培养皿
14、：洗热压热压 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干干热（干热箱）或晾干 接种用具：用接种用具：用CCL4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%酒精酒精烧烧培养基：湿热培养基：湿热培培养养材材料料外部细菌：用水冲洗外部细菌：用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理 内部细菌内部细菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸用化学试剂薰蒸污染来源污染来源无菌操作技术无菌操作技术1 1、实验器具和材料的准备、实验器具和材料的准备2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室
15、内及超的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。灭菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机，过、关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，进入缓冲间，以以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）工作台）4 4、用、用70707575的酒精拭擦台面并消毒双手。试
16、验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。能时间太长。5、取流水冲洗（至少、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34
17、次，放入次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。种器械进行分离、切割或其他处理。6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注意（注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（太快，以防空气流动，增
18、加污染机会。（2）不能用）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过
19、之后如不再重复使用，应立前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，
20、加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。管丢掉。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中以免空气中微生物落入瓶中正正 确确 错错 误误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正正 确确 错错 误误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错 误误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防
21、止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正正 确确 错错 误误接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中正正 确确 错错 误误n无菌操作无菌操作 无菌操作程序：（1）刷洗：表皮冲洗 （2）消毒：75%酒精 30秒 0.1生汞 8分钟 无菌水 3次 （3）切割：烟草叶片0.50.5cm 4-5片/瓶 （4）接种：平放在培养基上 （5）温室培养（名字、学号）接种及培养实验准备用品接种及培养实验准备用品用品：用品：n75%乙醇 1瓶n酒精棉球 1瓶n培养基 5瓶n烧杯（装升汞、酒精、蒸馏水用）3个n饭盒 1个n培养皿 1副n废液缸 1个接种及培养实验准备用品接种及培养实验准备用品用品：用品：n无菌水 1瓶n塑料膜 5张n解剖刀片 1片n打火机 1个n手套 1副n胡萝卜直根 1段n酒精灯 1盏n广口瓶（装工业酒精）1个
