高通量测序技术临床应用质量管理课件.ppt

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1、高通量测序技术临床应用高通量测序技术临床应用质量管理质量管理李金明 国家卫生计生委临床检验中心基因测序技术的发展基因测序技术的发展l1953年:DNA双股螺旋的发现双股螺旋的发现(英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick)l1965年:酵母tRNA测序(美国Comell大学Rober Holley,小片段重叠法)l1971年:噬菌体两个粘性末端的完整序列(吴瑞博士,华裔分子生物学专家,引物延伸测序)l1975年:加减法 DNA测序(英国剑桥大学Fred)l1977年:Sanger测序测序(英国剑桥大学Fred Sanger)和Maxam-Gillbert DNA化学降

2、解法测序(美国哈佛Alan Maxam&Walter Gilbert)l1996年:焦磷酸测序焦磷酸测序(瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等)l2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法,454 life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)l2007年:454、Solexa公司和Agencourt(SoliD测序仪)公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术新一代测序技术(next-generation sequencing)2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的

3、技术精准医学不等于高通量测序精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学的支点高通量测序是精准医学的支点高通量测序技术的临床应用高通量测序技术的临床应用l染色体非整倍体无创产前筛查染色体非整倍体无创产前筛查(NIPT)l胚胎植入前遗传学筛查(Preimplantation Genetic Screening,PGS)和胚胎植入前基因诊断(Preimplantation Genetic Dignosis,PGD)l肿瘤靶向治疗基因突变检测肿瘤靶向治疗基因突变检测l单基因遗传病检测l病原微生物检测:如HPV基因分型、宏基因组(Metagenomics)测序l高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理

4、高通量测序技术临床应用的规范化和质量管理l国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室:用试点实验室:评审标准、评审评审标准、评审、试点实验室试点实验室基本要求基本要求、管理试点实验室管理试点实验室l2015年增加年增加质评调查:质评调查:全国肿瘤诊断与治疗高全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测通量测序检测 l2016年新增年新增质评计划:质评计划:染色体非整倍体(染色体非整倍体(21、13、18)无创产筛)无创产筛l2016年即将增加年即将增加质评调查:质评调查:肿瘤游离肿瘤游离DNA(ctDNA)检测)检测批准的第一批四个专业的试点单位批准的第一

5、批四个专业的试点单位国家卫生计生委高通量测序试点国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求实验室要求基本要求(基本要求(1)l1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专批准的试点专业范围内业范围内开展临床检测工作。l2.试点实验室需采用高通量测序开展不少于一项不少于一项的检测项目。l3.为避免污染所致的假阳性结果,各试点实验室各试点实验室应根据所开展的检测项目进行分区应根据所开展的检测项目进行分区,具体各专业实验室的分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责发布。产前筛查与产前诊断产前筛查与产前诊断(全基因组低拷贝测序技术)(全基因组低拷贝测序技术)缓冲间缓冲间测序区测序区空气流向空气流向空气流向

6、空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向文库扩增文库扩增与检测区与检测区标 本 与 文标 本 与 文库制备区库制备区试剂准备区试剂准备区标本与文库制备区标本与文库制备区文库扩增与检测区文库扩增与检测区测序区测序区植入前胚胎遗传学诊断植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序全基因组低拷贝测序)缓冲间缓冲间测序区测序区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊文库检测区文库检测区WGA制备区制备区试剂准备区试剂准备区缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间空气流向空气流向空

7、 气 流空 气 流向向电泳区电泳区扩增一区扩增一区遗传病诊断遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗肿瘤诊断与治疗(杂交捕获测序技术(杂交捕获测序技术+Sanger测序验证)测序验证)DNA打断区打断区缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区杂交捕获区(扩增一区)(扩增一区)空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊文库扩增区文库扩增区(扩增二区)(扩增二区)标本与文标本与文库制备区库制备区试剂准备区试剂准备区文库检测区文库检测区测序区测序区电泳区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间

8、缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区杂交捕获区(扩增一区)(扩增一区)空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊文库扩增区文库扩增区(扩增二区)(扩增二区)标本与文库制备区标本与文库制备区试剂准备区试剂准备区文库检测区文库检测区测序区测序区电泳区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间关于关于“分区分区”、缓冲间和生物安全柜、缓冲间和生物安全柜“各区独立各区独立注意风向注意风向因地制宜因地制宜方便工作方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台

9、和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区,同样是“个体化”的,以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间缓冲间测序区测序区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向文库扩增文库扩增与检测区与检测区标 本 与 文标 本 与 文库制备区库制备区试剂准备区试剂准备区高通量测序实验室设计需注意的几点高通量测序实验室设计需注意的几点l电泳区电泳区:DNA提取、DNA片段化后大小鉴定等步骤需要用到电泳,单独成区,

10、但不同的检测项目可以共用该区域。l测序区测序区:应为恒温恒湿实验室,2小时温度波动应小于小时温度波动应小于2。l分区设置可根据自动化仪器设备引入做适当流程、区间整合。l无创产前筛查实验室,因血浆提取为胎儿微量DNA,为防止污染,不能与其他项目的标本制备区共用。l其他:实验室通风换气通风换气(10次次/小时小时)、生物安全柜等要求普通基因扩增实验室。基本要求(基本要求(2)l4.试点实验室如使用商品化试剂商品化试剂,则应当使用经过国家食品药品监督管理总局(国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准)批准的试剂,临床应用前应经过性能验证性能验证;如使用自配自配试剂(试剂(LDT),必须建立自配试剂的

11、标准操作程序,并经过性能评价性能评价。以上均须保存相应的实验记录。l5.试点实验室应对相应的检测仪器设备仪器设备进行日常的维护和定期校准维护和定期校准,并保存仪器维护校准记录。“性能验证性能验证”(“verification”)定义)定义l“verification”:broadly as“confirmation through the provision of objective evidence,that specified requirements have been fulfilled”.(广义为通过提供客观证据证明特定广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足的要求得到满足)lC

12、LIA uses the term“verification”:specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturers performance claims when the test is used according to the package insert.(CLIA性能验证术语特指性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用剂盒或检测系统说明书使用

13、时时,能能复现复现生产厂家生产厂家所所宣称宣称的检测性能的检测性能。)“性能确认性能确认”(“validation”)定义)定义lThe FDA and ISO both define the term“validation”as“confirmation by examination and provision of objective evidence that the particular requirements for a specific intended use can be consistently fulfilled”.(通过检查和提供客观证据证明,对一特通过检查和提供客观证

14、据证明,对一特定预期应用的要求始终能得到满足定预期应用的要求始终能得到满足)lThe FDA and ISO terms for verification and are similar,with the distinction having to do with intended use.(性能验证和性能确认(性能验证和性能确认FDA和和ISO术语相似,差异在后者的术语相似,差异在后者的“预期预期用途用途”)“intended use”预期用途预期用途 lThe term“intended use”in these documents is established by the manufa

15、cturer or developing laboratory at the time of assay development and has to do with the purpose and population for which the test was intended(e.g.,diagnosis,following treatment,etc.).Relevant performance characteristics are then determined based on the intended use of the test.lSome people interpre

16、t“intended use”as referring to the relevant clinical laboratory in which the test is performed,rather than the manufacturer or developing laboratory,thus causing confusion.The World Health Organization(WHO)defines validation as“the action(or process)of proving that a procedure,process,system equipme

17、nt or method used works as expected and achieves the intended result”.(WHO将将validation定义为定义为,证明所使用的一个程序、过程、系统设备证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动(或过或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动(或过程程)“validation”通俗一点的定义通俗一点的定义lthe term“validation”will be used to refer to the analytic performance characteristics that

18、need to be initially established at the time of assay development.(指在测定方法研发时,最指在测定方法研发时,最早建立的分析性能特征早建立的分析性能特征)NGS性能评价指标有哪些?性能评价指标有哪些?l精密度(precision):重复性研究l准确度(accuracy):方法学比较研究l分析灵敏度(analytical sensitivity):测定下限研究l分析特异性(analytical specificity):干扰物质研究l可报告范围(reportable range):可测定的基因区域研究基本要求(基本要求(3)l6.

19、试点实验室应对技术人员制定培训计划培训计划,进行相关的在岗持续培训在岗持续培训,保存人员培训记录。l7.试点实验室应建立日常检测的实验记录建立日常检测的实验记录方式方式,并保存相应记录。l8,试点实验室应建立规范的检测结果报告与建立规范的检测结果报告与解释模式解释模式。基本要求(基本要求(4)l9.试点实验室 应建立室内质量控制程序建立室内质量控制程序,在在日常检测中开展室内质量控制日常检测中开展室内质量控制,保存室内质控及其失控及定期综合分析的记录,并有质量改有质量改进措施进措施。l10.试点实验室应参加由国家卫生计生委组织参加由国家卫生计生委组织的相应项目的室间质量评价或进行有效的实验的相

20、应项目的室间质量评价或进行有效的实验室室间比对室室间比对,并保存室间质量评价或实验室室间比对记录,对不合格的结果应进行原因分析,并采取质量改进措施质量改进措施。室内质量控制室内质量控制(Internal quality control,IQC)l采用已知阴性已知阴性和弱阳性弱阳性质控品质控品进行室内质控是保证检测质量的关键环节,其监控的是实验室测定的最重要的性能指标即重复性重复性,并决定了当批实验测定是否有效,报告能否发出,是对实验室测定的即时性评价即时性评价。是质量改进的不质量改进的不可缺少的措施可缺少的措施。l阴性质控品阴性质控品:不是指突变阴性的样本,而是采用无模板对照(No Templ

21、ate Control,NTC)作为阴性质控品,阴性质控品需包含在所有的扩增步骤中,以证实在样本和试剂中没有核酸的污染。l阳性质控品阳性质控品:包括至少一个已知突变位点至少一个已知突变位点,最好变异百分比接近检测下限变异百分比接近检测下限,以证实低百分比的突变可在每批次中检出。l质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型无需在每批检测中包括所有突变类型,只需加入一个已知突变位点一个已知突变位点的质控品。但是,实验室最好有多个突变的质控品最好有多个突变的质控品,并在日常检测中轮流使轮流使用用。l质控样本可以采用人基因组可以采用人基因组DNA或其他合成的带有突变的基因组其他合成的带有突变的基因组DN

22、A(不建议采用质粒)。但是这种质控品不能监测提取过程。临床样本当然是最理想的质控品,但是样本来源有限,很难长期使用。室间质量评价室间质量评价(External quality assessment,EQA)lEQA或实验室间比对的目的或实验室间比对的目的:监测实验室测定准准确性确性或结果可比性结果可比性;是质量改进的不可缺少的措质量改进的不可缺少的措施施。lEQA样本样本:肿瘤靶向治疗涉及的基因位点较多,EQA往往难以覆盖所有的情况,而且为保证EQA样本的来源和重复性,EQA组织者可能采用细胞采用细胞系系或人基因组人基因组DNA作为评价样本评价样本l临床实验室可通过临床样本的实验室间比对临床样

23、本的实验室间比对,来来作为补充作为补充。基本要求(基本要求(5)l11.试点实验室应制定包括以下内容的标准操作程序(标准操作程序(SOP)及相关记录表格:(1)样本的采集、运送、保存、接收、登记和处理;(2)知情同意告知;(3)检测方法和步骤;(4)试剂和耗材的选择和保存(如为自配试剂,需详细写明试剂的制备过程以及各原料的来源);(5)试剂性能验证或自配试剂的性能评价和方法确认;(6)仪器的使用、维护和校准;(7)人员培训;(8)结果报告与解释;(9)实验室数据、相关文件记录与保存;(10)室内质量控制;(11)室间质量评价或实验室间比对;(12)知情同意和保密程序。l12.其他未尽的事项要求

24、,试点实验室均应参照医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法。实验室质量管理的实验室质量管理的“灵魂灵魂”源于一些标准文件(如仪器试剂说明书、国际国内标准文件)和实验室实际工作经验积累。因此因此高于相关标准文件高于相关标准文件!SOP等于试剂盒说明书吗?标准操作程序(标准操作程序(SOP)是实验室的)是实验室的“最高标准最高标准”!有有可操作性可操作性的的SOP是是质量管理质量管理的的“灵魂灵魂”!试点实验室可参考的一些指南性文件试点实验室可参考的一些指南性文件个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称指南名称负责人负责人药物代谢与效

25、应基因多态性检测相关技术指南 周宏灏院士肿瘤相关的个体化医学检测技术指南詹启敏院士曾益新院士遗传病相关个体化医学检测技术指南曾溢滔院士病原微生物相关的个体化医学检测技术指南尚 红教授芯片技术的个体化医学检测应用技术指南程 京院士测序技术的个体化医学检测应用技术指南于 军教授原位杂交技术的个体化医学检测应用技术指南陈 杰教授个体化医学检测LDT的相关技术指南程 京院士个体化医学检测实验室管理办法尚 红教授李金明教授 美国美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南制订的一些与分子检测有关的导则或指南项目项目名名 称称内内 容容1CLSI/NCCLS MM1A基因疾病的分子诊断方法基因疾病的分

26、子诊断方法2CLSI/NCCLS MM2-A2免疫球蛋白和免疫球蛋白和T细胞基因重排检测细胞基因重排检测3CLSI/NCCLS MM3-P2传染性疾病的分子诊断方法4CLSI/NCCLS MM5-A分子血液病理学的核酸扩增检测5CLSI/NCCLS MM6传染性疾病定量的分子检测方法6CLSI/NCCLS MM7-A医学遗传检测中荧光原位杂交方法7CLSI/NCCLS MM9-A实验室诊断医学中的核酸测序方法实验室诊断医学中的核酸测序方法8CLSI/NCCLS MM10-P传染性疾病的基因分型9CLSI/NCCLS MM12-P诊断用核酸芯片芯片10CLSI/NCCLS MM13-A分子诊断方

27、法中标本收集、运输、处理和储存分子诊断方法中标本收集、运输、处理和储存11CLSI/NCCLS MM14-A分子诊断方法中的能力验证分子诊断方法中的能力验证12 CLSI/NCCLS MM14-A2分子检测能力验分子检测能力验/室间质量评价设计室间质量评价设计13CLSI/NCCLS MM16-P外源RNA对照用于基因表达检测14 CLSI/NCCLS MM20-A分子遗传检测的质量管理 高通量测序室间质量评价高通量测序室间质量评价l染色体非整倍体(T21、T18和T13)无创产前筛查l肿瘤基因突变高通量测序检测2014年全国外周血胎儿染色体非整倍体(年全国外周血胎儿染色体非整倍体(T21、T

28、18和和T13)高通量测序检测室间质量评价调查活动样本信息)高通量测序检测室间质量评价调查活动样本信息样本编号样本编号预期结果预期结果样本性质样本性质胎儿游离胎儿游离DNADNA浓度浓度是否计分是否计分2121号染色体非整倍体号染色体非整倍体1818号染色体非整倍体号染色体非整倍体1313号染色体非整倍体号染色体非整倍体1401阴性阴性阴性阴性阴性阴性染色体正常阴性样本染色体正常阴性样本 是是1402阳性阳性阴性阴性阴性阴性T21610%是是1403阴性阴性阳性阳性阴性阴性T184%否否1404阴性阴性阴性阴性阴性阴性性染色体异常性染色体异常XXX 是是1405阴性阴性阴性阴性阳性阳性T136

29、10%是是1406阴性阴性阳性阳性阴性阴性T1810%,70%嵌合嵌合是是1407阴性阴性阴性阴性阴性阴性染色体正常阴性样本染色体正常阴性样本 是是1408阴性阴性阳性阳性阴性阴性T18610%是是1409阴性阴性阴性阴性阴性阴性染色体正常阴性样本染色体正常阴性样本 是是1410阳性阳性阴性阴性阴性阴性T2110%,30%嵌合嵌合否否1411阴性阴性阳性阳性阴性阴性T1810%,30%嵌合嵌合否否1412阴性阴性阴性阴性阴性阴性染色体正常阴性样本染色体正常阴性样本 是是1413阴性阴性阴性阴性阳性阳性T1346%是是1414阳性阳性阴性阴性阴性阴性T2146%是是1415阳性阳性阴性阴性阴性阴

30、性T2110%,70%嵌合嵌合是是1416阴性阴性阴性阴性阴性阴性染色体正常阴性样本染色体正常阴性样本 是是1417阴性阴性阴性阴性阳性阳性T134%否否1418阴性阴性阳性阳性阴性阴性T1846%是是1419阳性阳性阴性阴性阴性阴性T215M3.2M41.9646M2M41.9640.200ng/lNA3.0M3.112.393.113.5M1.8M3NA3233.52.53.53pM5M3M31.9632 ng/l 10 M4M3.52.83.51 nmol/LNA3M3230.20ng/lNA3M3233NA4245ng/ul6M5M3.52.5-3.510%EGFRNM_005228.

31、3(EGFR):c.493CT(p.Arg165Trp)450%FGFR3NM_000142.4(FGFR3):c.1948AC(p.Lys650Gln)1450%IDH1NM_005896.2(IDH1):c.395GA(p.Arg132His)450%RETKIF5BENST00000302418:r.1_2183_RETNM_020975:r.2327_5629E15:E1220%1502FGFR2NM_000141.4(FGFR2):c.1124AG(p.Tyr375Cys)950%PTPN11NM_002834.3(PTPN11):c.182AG(p.Asp61Gly)320%ROS

32、1SDC4ENST00000372733:r.1_239_ROS1NM_002944:r.5448_7368E2:E3210%TP53NM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)550%1503BRAFNM_004333.4(BRAF):c.1799TA(p.Val600Glu)1520%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2573TG(p.Leu858Arg)2150%FLT3NM_004119.2(FLT3):c.2520_2521insGGATCC(p.Ser840_Asn841insGlySer)2050%KRAS

33、NM_033360.3(KRAS):c.34GC(p.Gly12Arg)210%1504ALKEML4ENST00000318522:r.1_1751_ALKENST00000389048:r.4080_6220E13:E2020%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser752delinsAla)1950%ERBB2NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TTCC(p.Leu755Pro)1950%NOTCH1NM_017617.3(NOTCH1):c.5965GA(p.Asp1989Asn)3250%NRASN

34、M_002524.4(NRAS):c.35GA(p.Gly12Asp)220%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1664AG(p.Tyr555Cys)1250%1505AKT1NM_001014432.1(AKT1):c.49GA(p.Glu17Lys)250%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val561insGluArg)1220%KRASNM_004985.3(KRAS):c.34GT(p.Gly12Cys)21%1506EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2156GC(p.G

35、ly719Ala)1850%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1821GC(p.lys607Asn)1450%NRASNM_002524.4(NRAS):c.38GA(p.Gly13Asp)250%GNASNM_000516.4(GNAS):c.601CA(p.Arg201Ser)820%1507HRASNM_005343.2(HRAS):c.181CA(p.Gln61Lys)350%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1821GC(p.Lys607Asn)1450%KITNM_000222.2(KIT):c.1675_1680delGTTGTT(p.Val559_V

36、al560del)1120%PIK3CANM_006218.2(PIK3CA):c.1624GA(p.Glu542Lys)1010%1508ALKKIF5BENST00000302418:r.1_3219_ALKNM_004304:r.4080_6222E24:E2020%BRAFNM_004333.4(BRAF):c.1405_1407del3(p.Gly469del)1120%IDH2NM_002168.2(IDH2):c.419GA(p.Arg140Gln)41%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1849GT(p.Val617Phe)1450%肿瘤基因突变NGS质评所有样本

37、均为人基因组DNA(从细胞中提取),样本量30l,浓度3050 ng/l。其中,1501-1508号样本检测体细胞突变,提供正常基因组DNA一份(样本编号为15NC),15NC代表临床上来自患者外周血或者正常组织样本中提取的基因组DNA。不同不同panel的的实验室数实验室数(按基因数分(按基因数分类)类)PT成绩(分)成绩(分)评价结果评价结果总计10080100(含80)6080(含60)060(不含0)0合格不合格403241037814182040(含含20)113310465不同不同panel的的实验室数实验室数(按基因数分类)(按基因数分类)PT成绩(分)成绩(分)评价结果评价结果总计10090100(含90)6090(含60)060(不含0)0合格不合格1020(含含10)1523622510101437202104表2-1.实验室质评成绩情况表2-2.实验室质评成绩情况100%正确正确的实验室只占用6.7%(12/72);合格51.2%(37/72);22.2%(16/72)为0分高通量测序实验室质量管理高通量测序实验室质量管理“难难”的原因的原因l涉及的实验室多l人员质量意识不够任重道远!任重道远!没有没有精准的检测精准的检测何来何来精准医学精准医学!

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