1、2022年11月26日星期六第一章组织培养基本原第一章组织培养基本原理和设施理和设施一、植物组织培养的基本原理 n1.植物细胞全能性 植物细胞的全能性植物细胞的全能性：植物细胞的全能性是指植物体的每个具有完整细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的潜在能力。原理原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。两个含义：1）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息.2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力.差异：差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精
2、卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因：潜在全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。2、植物细胞的分化 植物细胞分化植物细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。植物细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础。植物个体的发育是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果。在整个植物生长发育过程中，由于顶端分生组织活跃分裂的结果，通过一系列复杂的形态发生过程，形成不同的器官和组织，即在植物体内分化出
3、了各种不同类型的细胞群。从而使植物体的成熟部分具有了复杂的内部结构，最后开花结实完成其生活史。细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞的分化就没有形态建成。细胞分裂、生长、分化是生物体发生的三个基本现象。细胞分化的结果：细胞分化的结果：导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能。植物的每个生活细胞具有全能性，但任何一个细胞在其整个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个细胞在不同的时间、空间和内外条件下，表达的内容是不同的，因而就出现了机能和形态的差异。所以，分化也可说是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型。细胞的结构和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分工
4、的不同。在系统发育上，植物越进化，细胞分工越细致，细胞的分化就越剧烈，植物体的内部结构也就越复杂。n 细胞分化是一个复杂的问题，同一植物的所有细胞均来自于受精卵，它们具有相同的遗传物质，但它们却可以分化成不同的形态；即使同一个细胞，在不同的内外条件下也可能分化成不同的类型。细胞的极性、细胞在植物体中的位置、细胞的发育时期、各种激素和某些化学物质，以及光照、温度、湿度等物理因素都能影响分化。所以我们可以通过人为的控制，使得分化的结果能够满足人们的需要。在分化的控制上，激素的调节作用是十分重要的。但调控因子是十分复杂的，另外像外界环境因子(光、温度等)及细胞和组织内本身的启动和操纵，都能影响到细胞
5、分化。3.3.植物激素在形态建成中的作用植物激素在形态建成中的作用 植物激素是植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量有机物。植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源起着十分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生长调节剂。人工合成的植物生长调节剂。植物生长植物生长调节物质调节物质植物激素植物激素植物生长调节剂植物生长调节剂在植物组织培养中使用的生长调节物
6、质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等。（1）种类）种类IAANAAIBA2,4D（2）作用：）作用：诱导愈伤组织形成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分诱导愈伤组织形成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。化和促进细胞分裂、伸长生长。生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的形成和植株生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的形成和植株再生可以起到调控作用，它们的比例决定着发育的细胞类型，再生可以起到调控作用，它们的比例决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽。生长素生长素/细胞分裂素的比值高
7、，有利于根的形成和愈伤组织的细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于形成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于芽的形成。芽的形成。根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是茎和芽。茎和芽。1 1、生长素、生长素(auxin)(auxin)nIAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的 副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。nNAA(萘乙酸萘乙酸)在组织培养中的起动能力要
8、比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。nIBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。n2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。n生长素配制可先用少量95酒精助溶。n2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。注意：天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在
9、植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。2 细胞分裂素类细胞分裂素类 这类激素是腺嘌呤的衍生物，细胞分裂素有激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、2异戊烯腺嘌呤（2ip）和6-苄基腺嘌呤（BAP）等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：n诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的产生。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。n促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与器官分化、延缓组织衰老，增强蛋白质合成诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖。n抑制根的分化。避免在生
10、根培养时使用。n3 GA(赤霉素赤霉素)n种类：种类：种类多，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是培养基中添加的是GA3。n作用：作用：主要用于促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎提前萌发等。n特性：特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当采用过滤灭菌法加入。n 脱落酸（ABA）在组织培养中很少使用。有些例子表明，加在培养基中的脱落酸，或是能促进愈伤组织的生长，
11、或是能抑制它的生长，其作用因物种而不同，在胚培养中，脱落酸能抑制胚的早熟萌发，促进晚期胚胎的正常成熟。另外，在植物种质资源超低温冷冻保存时，可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成，从而保证冷冻保存的顺利进行。n 乙烯对组织培养物芽的诱导和形成有促进或抑制作用，这与植物种类及处理时间有关。如乙烯和二氧化碳的相互作用对针叶树芽的诱导有较大影响。二、植物组织培养的常用设施、设备及培养二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环境环境 在进行植物组织培养工作之前，首先应对工在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地
12、制宜地利用现有房屋，或新建、改建实以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模：1.1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。限制生产影响效率。2.2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计来设计,避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用要做到无菌的条件，需
13、要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。养条件。组培的组培的技术路线技术路线：外植体愈伤组织不定芽生根再生植株基本的基本的工艺流程工艺流程：容器具洗涤，物质准备配置培养基并灭菌外植体消毒与无菌操作接种观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）再生植株实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。实验室组成：准备室、无菌操作室、培养室、温室。（一）基本设施1、准备室准备室 在准备室主要进行一些常规的实验操作，如植物组织培养中所需器皿和其它仪器的清洗、干燥和保存，培养基的制备和灭菌，常规的生理生化分析等。植物组织培养中
14、常用的化学试剂、玻璃器皿也存放在这里。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和培养基配制室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；培养基配制室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。准备室里通常摆放着植物组织培养中常用的仪器设备，包括普通天平和分析天平、低温冰箱（若无低温冰箱，普通冰箱也可）、水浴锅、磁力搅拌器、高压灭菌锅、烘箱、酸度计、恒温培养箱、微波炉和电磁炉，还应配备放置药品和玻璃仪器的橱柜。在没有细胞学实验室作为配套实验室的情况下，植物石蜡切片和组织染色的设备也放在这里，如石蜡切片机、恒温箱、烘片箱和染色缸等。显微镜、体视显微镜等可以放在无菌操作室内，这样才满足对培养
15、材料生长情况记录的要求。可见，准备室要有足够的空间和一个较大的工作台，以满足植物组织培养中培养基的制备、材料处理和实验观察研究等工作。植物组织培养研究离不开拍照，还需配备光学相机或数码相机。n2.无菌操作室植物组织培养的无菌操作是进行植物材料的消毒、分离接种以及培养物的继代转移操作的场所。超净工作台是无菌操作室的主要设备。超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。n类型n作用n3、培养室、培养室：是接种的材料培养生长的场所。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。主要设备：培养架（控温控光控湿）、空调、摇床、培养箱、紫外光源等。培养条件：T252；L10006000Lx；t1
16、0-16 h/d ；70RH80%维护方法：清洁、卫生，保持一定空气洁净度。n4.温室在具备温室条件的地方，可以在温室栽培材料，供植物组织培养取材只用。温室为植物提供良好的生长环境，可以根据需要随时栽培，也可以为组织培养提供健康的植物材料，从而使初代污染得到有效控制。同时，温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所，温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相应药剂等。n（二）主要仪器和设备 1、常用设备（1）无菌操作设备 包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等。n类型n作用仪仪 器器 设设 备备高压灭菌锅高压灭菌锅手提式灭菌锅手提式灭菌锅 烘箱n作用（2）培养设备
17、（3）药品贮存和配制仪器设备 冰冰 箱箱n作用天天 平平n作用：n作用PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计（4）观察分析仪器设备n类型：n（5）其他仪器设备 离心机。进行原生质体分离时，需要离心机。蒸馏水制备装置。需要时，还可进行重蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水。除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾干架等也是植物组织培养中所需要的.n2.主要器皿 培养用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高压蒸汽灭菌。根据培养目的和要求不同，可采用不同种类和规格的玻璃器皿。一般用：试管、三角瓶（锥形瓶）、果酱瓶或罐头瓶、培养皿、植物组织培养专用容器n 离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从培养基中分离
18、出来，并进行收集。主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等用于配制培养基、储藏母液、材料消毒等的各种化学实验玻璃器皿。n3.器械类3.调控组织培养的主要环境条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。培 养 条 件 温度1、温度（、温度（temperature)温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养在2327之间进行，一般采用252。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。月季的最适温度是2527、番茄是
19、28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。培 养 条 件 温度培 养 条 件 2、光照（、光照（light）组织培养中光照也是重要的条件之一，光强 主要表现在 光质 光照时间 培 养 条 件 光 照1）光照强度（）光照强度（light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。光照强度：1000lx5000lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化 百合原球茎：黑暗下长出小
20、球茎，关照下长出叶片培 养 条 件 光 照2）光质（）光质（light wave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍培 养 条 件3）光周期（）光周期（light period)试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄
21、，茎切段培养在短日照下形成根。培 养 条 件 3、湿度（、湿度（humidity)湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件。1）容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。培 养 条 件n 2）环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度
22、的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。培 养 条 件 4、渗透压（、渗透压（penetrating pressure)培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。培 养 条 件 5、PH值值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在56.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。培 养 条
23、 件不同植物的最适不同植物的最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越橘 4.5 胡萝卜 6.0 石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.7培 养 条 件 以硝态氮硝态氮作氮源比以铵态氮铵态氮作氮源PH值较小一些。一般来说PH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。PH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。培 养 条 件 6、气、气 体（体（gas)n 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。n 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。n 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。n 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。金花茶滤纸桥液体培养生根牡丹山茶在增殖蝴蝶兰试管苗开花情况非洲紫罗兰壮苗生根
