1、1,NK细胞毒检测,王飞 E-mail：fei 于彬 E-mail：yubin,2,自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生发展。 NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。,NK细胞活性检测,3,实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定,主 要 内 容,4,器材 75%酒精 若干 5ml注射器 1个/组 100ml烧
2、杯 1个/组 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 无菌离心筒 1个/组 可调微量加样器 1套/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 1套/ 组 细胞培养箱 1台/room 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 1台/组,动物、细胞及试剂 小鼠 1只/组(NS,OVA) YAC-1 1*106 * 2ml 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组 培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组 LDH底物 3ml/组 柠檬酸（终止液） 1ml/组,分组： 每组4人 1只小鼠,实验分组
3、及材料,5,NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。,原 理,通过杀伤激活受体（KAR）直接识别,通过抗体间接识别：ADCC,分泌杀伤介质： perforin granzyme TNF IFN,清除异常细胞 （肿瘤、病原体感染）,NK细胞功能：清除异常细胞,通过杀
4、伤激活受体（KAR）直接识别,通过抗体间接识别：ADCC,实验原理,NK细胞+靶细胞,靶细胞破裂,释放内容物,胞浆内酶类 LDH酶活性,胞浆内蛋白 放射性铬酸钠 51Cr标记,DNA 3H-TdR掺入,10,密度梯度离心 Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心 磁化细胞分离器分离法,NK细胞分离方法,11,同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用),常用的检测方法,12,G0,G1,S,Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR,New DNA Or Protein,cpm,同位素释放法,13,应用放射性同位素（ 如5
5、1Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)，即可计算出NK细胞毒活性。,同位素释放法,14,乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的值，可测得杀
6、伤细胞毒活性。,乳酸脱氢酶释放法-原理,15,靶细胞 YAC-1,NK 杀伤,LDH 释放到细胞外,无色底物,LDH底物,还 原,有色物质,测OD570值,乳酸脱氢酶释放法,靶细胞 膜损伤,最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值,杀伤率( %)=,Max- S自发,实验值-自发释放值,100,16,操作流程,1W,无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无FBS),细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝,加板(三复孔) (加法
7、见附图),调细胞浓度 1107 /ml,5%CO2 37培养2小时,离心，取100ul上清移入新孔， 37孵育10min,加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min,30l /孔 1mol/L柠檬酸,酶标仪测吸光度值：OD570nm,结果判定：,培养YAC1细胞 10%FBS 1640培养液,调细胞浓度 1106/ml,17,单细胞悬液的制备 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml 1640培养液的平皿内。 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50
8、ml 离心管中，再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中，剩余3ml培养液备用。 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 调脾细胞浓度至1108/ml，每组所需总量为1ml 调YAC1细胞浓度至1106/ml，每组需2ml 注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。,实
9、验步骤,18,细胞培养： 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO2培养箱中，培养2小时。 LDH底物： 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 室温避光保存15min。 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 结果判定： Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值 注： S自发 0，做“0”处理,实 验 步 骤,SI=,Max- S自发,实验孔值-自然释放孔值,100%,19,Max=E-F S自发=A-G,加 板 方 法,20,结 果 处 理,算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标为E:T,纵坐标为SI值。 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上。 要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。,21,Excel 作 图,
