1、药物杂质检查,吉林大学国家级生物实验教学示范中心,1、葡萄糖中的一般杂质检查 2、药物中特殊杂质的检查,药物的杂质 检查,吉林大学生物基础实验教学中心,1、目的要求 2、实验原理 3、试剂与器材 4、实验步骤 5、注解 6、思考题,目的要求,掌握一般杂质检查的目的和原理。 熟悉杂质检查的一般操作方法。,实验原理,1. 氯化物检查法 氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银作用，生成氯化银微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样的条件下，用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，测定供试品中氯化物的限量。 Cl- + Ag+ AgCl,实验原理,2. 重金属检查法 重金属是指在弱酸性(pH33
2、.5)溶液中，能与硫代乙酰胺或硫化钠作用生成硫化物的金属杂质。在药品生产中遇到铅的机会比较多，铅又易积蓄中毒，故检查时以铅为代表。同上法，硫代乙酰胺分别和样品、标准品生成有硫化物的均匀沉淀，再比较判断样品中的重金属限量。 CH2CSNH2+H2O CH3CONH2+H2S Pb 2+ + H2S PbS,实验原理,3. 砷盐检查法 本法系采用锌和酸作用所产生的初生态氢与供试品中微量砷盐化合物反应生成挥发性砷化氢，再与溴化汞试纸作用生成黄色至棕色砷斑。比较供试品与标准砷溶液在同一条件下所显的砷斑的颜色深浅，以测得供试品的含砷限度。 AsO33-3Zn9H+AsH33Zn2+3H2O AsH32H
3、gBr22HBrAsH(HgBr)2(黄色) AsH33HgBr23HBrAs(HgBr)3(棕色) （选做）,实验原理,五价砷在酸性溶液中也能被金属锌还原为砷化氢，但生成砷化氢比三价砷慢。三价砷生成砷化氢在2h内已反应完全，而五价砷在同时间内仅五分之一起反应。为了防止五价砷存在，影响测定结果的准确性，故必须加入碘化钾、酸性氯化亚锡还原剂，将五价砷还原为三价砷。碘化钾被氧化生成I2，以氧化亚锡来还原，使反应液中维持有碘化钾的还原剂存在。 AsO43-2I-2H+AsO33-I2H2O AsO43-Sn2+2H+AsO33-Sn4+H2O I2Sn2+2 I-Sn4+ 溶液中的碘离子，与反应中产
4、生的锌离子能形成配合物，使生成砷化氢的反应不断进行。 4I-Zn2+ZnI42-,实验原理,氯化亚锡与碘化钾存在，还可抑制锑化氢生成，在实验条件下，100 g锑存在不至于干扰测定。同时氯化亚锡的作用可在锌粒表面形成锌锡齐（锌锡的合金）起去极化作用，使锌粒与盐酸作用缓和，放出氢气均匀，使产生的砷化氢气体一致，有利于砷斑的形成，增加反应的灵敏度与准确度。 Sn2+ZnSnZn2+,样品 标准砷溶液,还原反应(25-40 ),AsH3,砷斑,标准砷 溶液,样品,醋酸铅棉花,溴化汞试纸,H2S,试剂与器材,1、材料：药用葡萄糖（分析型）、稀硝酸、硝酸银、氯化钠、磺基水杨酸、硝酸铅、醋酸铵、稀硫酸或浓硫
5、酸、浓盐酸 2、器材：天平、容量瓶10 ml、纳氏比色管 （25 ml） 等,实验步骤,1. 溶液的澄清度与颜色 取药用葡萄糖（分析型）5.0 g置于100ml烧杯中，加热水溶解后放冷，用去离子水稀释至10 ml，溶液应澄清无色，如显浑浊，与1号浊度标准液(1) （取浊度标准原液5.0 ml，加水95.0 ml，摇匀）10 ml比较，不得更深，如显色，与对照液（取比色氯化钴液3 ml，比色用重铬酸钾液3 ml与比色用硫酸铜液6 ml，加水稀释至50 ml）1.0 ml加水稀释至10 ml，比较，不得更深。,实验步骤,2. 氯化物(2) 取药用葡萄糖（分析型）0.3 g置于100ml烧杯中，加去
6、离子水溶解使成12.5 ml（如显碱性，可滴加稀硝酸使遇石蕊试纸显中性反应），再加稀硝酸5 ml，溶液如不澄清，应过滤。置25 ml纳氏比色管中，加水适量使成约 20 ml (3)，加硝酸银试液0.5 ml，用水稀释使成25 ml，摇匀在暗处放置5 min，如发生浑浊，与对照溶液（标准氯化钠溶液1.0 ml，加入一定量的硝酸银试液，再加水稀释使成50 ml，摇匀，在暗处放置5 min），比较，不得比对照溶液更浓。,实验步骤,3. 蛋白质 取药用葡萄糖（分析型）1.0 g置于100ml烧杯中，加去离子水10 ml溶解后，加入磺基水杨酸溶液3 ml，不得发生沉淀。,实验步骤,4. 重金属 取25
7、ml纳氏比色管两支，一管加标准铅溶液2.0 ml，醋酸盐缓冲液(5) (pH 3.5)2.0 ml，加水至25 ml；另一支管取药用葡萄糖（分析型） 4.0 g，加去离子水23 ml溶解，加醋酸盐缓冲液 (pH 3.5) 2.0 ml；各管分别加硫代乙酰胺试液(6) 2 ml，摇匀，放置2 min，同置白纸上，自上向下透视，供试液显出的颜色与标准比较不得更深。,注意事项,临用时现配，使用前充分摇匀。 标准对照法。 目的是稀释Cl-浓度，产生浑浊而不是沉淀。 酸性物质可沉淀蛋白质。 在pH33.5时PbS沉淀较完全。 硫代乙酰铵试液是硫代乙酰胺溶液1ml与混合液5ml水浴加热20s，冷却后立即使
8、用。,思考题,实验中各项杂质检查的目的是什么？ 重金属检查原理是什么？ 实验中应注意些什么？（实验关键）,药物中特殊杂质的检查,吉林大学生物基础实验教学中心,1、目的要求 2、试剂与器材 3、实验步骤 4、注解 5、思考题,目的要求,1. 掌握试验中特殊杂质的来源和检查原理。 2. 掌握特殊杂质检查中的一般操作方法。,试剂与器材,1、材料：阿司匹林、乙醇、硫酸铁铵、水杨酸、冰醋酸、 氢化可的松、氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醚、四氮唑蓝、氢氧化钠 2、器材：容量瓶（1000 ml/50 ml）、试管或10 ml EP管、层析板 10 cm5 cm、层析缸、110 烘箱、喷壶（薄层层析喷显色剂用）,实
9、验步骤,1. 阿司匹林中游离水杨酸的检查 取本品0.1 g，加乙醇1 ml溶解后，加冷水适量使成50 ml，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液1ml，摇匀；30 s内如显色，与对照液（水杨酸铁试液 ）比较，不得更深（0.1%）。,实验步骤,2. 氢化可的松中其它甾体的检查 取本品，加氯仿-甲醇(9:1)制成每1 ml中含5.0 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿-甲醇(9:1)稀释制成每1 ml中含600 mg的溶液，作为对照液。照薄层色谱法实验，吸取上述两种溶液各5 ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385:60:30:2)为展开剂，展开后，晾干，在105干
10、燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显示杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,点样 微量注射器或定量毛细管。一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。,注意事项,1. 游离水杨酸的检查样品应尽量干燥，不得带入过多水分，否则样品加醇后不易溶解。 2. 点样采用微量注射器进行，在距薄层板2.5 cm处开始，点样应少量多次点于同一原点处，原点面积应尽量小。 3 碱性四氮唑蓝试液应临用新配。新鲜试剂应黄色，颜色如变深色不宜使用。,思考
11、题,薄层色谱法检查氢化可的松中其它甾体的原理是什么？为何用稀释液作对照？ 2. 试计算阿司匹林中游离水杨酸、氢化可的松中其它甾体的杂质限度。,本实验中各溶液的配制方法,1，标准氯化钠溶液： 称取氯化钠0.165g，置于1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。临用前，取储备液10ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。（每1ml10g的Cl） 2，标准铅溶液： 称取硝酸铅0.160g置于1000ml容量瓶中，加硝酸5ml，水50ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。临用前，取储备液10ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。 （每1ml10
12、g的Pb） 3 ，硫代乙酰胺试液 取硫代乙酰胺4g，加水使溶解成100ml,置冰箱中保存。临用前取混合液由1mol/L氢氧化钠溶液15ml、水5.0ml及甘油20ml组成5.0ml，加上述硫代乙酰胺溶液1.0ml，置水浴60度上加热20秒钟，冷却，立即使用。,本实验中各溶液的配制方法,4，硫酸铁铵指示液： 取硫酸铁铵8g，加水溶解，稀释至100ml，即得。 5，浊度标准贮备液的制备： 称取于105干燥至恒重的硫酸肼1.00g，置100ml量瓶中，加水适量使溶解，必要时可在40的水浴中温热溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，放置46小时；取此溶液与等容量的10%乌洛托品溶液混合，摇匀，于25避光静置2
13、4小时，即得。本液置冷处避光保存，可在两个月内使用，用前摇匀。 6，浊度标准原液的制备： 浊度标准贮备液15.0ml，置1000ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，取适量，置1cm吸收池中，照紫外-可见分光光度法(附录A)，在550nm的波长处测定，其吸光度应在0.120.15范围内。本液应在48小时内使用，用前摇匀。,本实验中各溶液的配制方法,7，浊度标准液的制备： 浊度标准液的制备取浊度标准原液与水，按下表配制，即得。本液应临用时制备，使用前充分摇匀。,本实验中各溶液的配制方法,8，碱性四氮唑蓝溶液： 取含0.2四氮唑蓝的甲醇溶液10ml与12NaOH的甲醇溶液30ml，临用时混合。 9，比
14、色对照液： 取比色氯化钴液3 ml，比色用重铬酸钾液3 ml与比色用硫酸铜液6 ml，加水稀释至50 ml。比色氯化钴、比色用重铬酸钾、比色用硫酸铜配制方法如下：,本实验中各溶液的配制方法,10，稀硝酸 ： 取硝酸10.5ml，加水稀释至100ml，即得。本液含HNO3应为9.510.5。 11，醋酸盐缓冲液： 醋酸-醋酸钠缓冲液（PH3.6），取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，用水稀释至250ml即得。,本实验中各溶液的配制方法,12，硝酸银溶液 ： 取硝酸银18.4g，溶解于适量水中，定容至1000ml即得。0.1mol/LAgNO3 13，水杨酸铁试液 ： （1）取硫酸铁铵0.1g，加稀硫酸2ml与水适量使成100ml。 （2）取水杨酸钠1.15g，加水使溶解成100ml。 （3）取醋酸钠13.6g，加水使溶解成100ml。 （4）取上述硫酸铁铵溶液1ml，水杨酸钠溶液0.5ml，醋酸钠溶液0.8ml与稀醋酸0.2ml，临用前混合，加水使成5ml，摇匀，即得。 14, 磺基水杨酸溶液： 取磺基水杨酸0.1g加适量水溶解，定容至1000ml.(1g/L).,本实验中各溶液的配制方法,各组分工： 一组：硫酸铁胺溶液 二组：硫代乙酰胺溶液 三组：醋酸盐缓冲液 四组：硝酸银溶液 五组：标准氯化钠溶液 六组：磺基水杨酸 七组：氯化物检查对照溶液,
