1、第六章免疫比浊分析第六章免疫比浊分析v 免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。一项分析技术。第二节第二节 自动化免疫比浊分析自动化免疫比浊分析 第一节第一节 免疫比浊的原理免疫比浊的原理 一、透射免疫比浊法一、透射免疫比浊法 二、散射免疫比浊法二、散射免疫比浊法 三、免疫胶乳比浊法三、免疫胶乳比浊法 四、免疫比浊分析的影响因素和临床四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用应用第一节第一节 免疫浊度分析原理免疫浊度分析原理 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小抗原、抗体在特定的电解质
2、溶液中反应，形成小分子免疫复合物（分子免疫复合物（19S19S19S），使反），使反应液出现浊度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表应液出现浊度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表示。示。第一节第一节 免疫浊度分析原理免疫浊度分析原理 在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。免疫比浊技术分类：免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法透射免疫比浊法（turbidimetric immun
3、oassay）散射免疫比浊法散射免疫比浊法（nephelometry immunoassay）速率散射比浊法速率散射比浊法终点散射比浊法终点散射比浊法 一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，由于液时，由于溶液溶液中的免疫复合物微粒对光线的吸收、中的免疫复合物微粒对光线的吸收、反射和折射而使透射光减少，可用反射和折射而使透射光减少，可用吸光度表示吸光度表示。在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。体的量呈
4、函数关系。一、免疫透射比浊法一、免疫透射比浊法（一）原理：（一）原理：抗原抗体反应曲线抗原抗体反应曲线 1.1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）操作方法（二）操作方法 2.2.将待测标本和标准抗原溶液（将待测标本和标准抗原溶液（5 5个浓度抗原标准个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在原抗体反应完成后，在340nm340nm处测定各管吸光度。处测定各管吸光度。3.按按log-logit转换或转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线方程进行曲线拟合，制备剂量拟合，制
5、备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。出抗原浓度。待测的抗原抗体复合物分子量足够大。待测的抗原抗体复合物分子量足够大。抗原抗体复合物数量足够多。抗原抗体复合物数量足够多。具有充分的反应时间，只能测定抗原抗具有充分的反应时间，只能测定抗原抗体反应的第二阶段。体反应的第二阶段。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。（三）技术要求（三）技术要求（四）方法评价（四）方法评价 优点优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确 不足不足:抗体用量较大；抗体用量较大；溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大溶
6、液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关。素密切相关。二、免疫散射比浊
7、法二、免疫散射比浊法(一一)原理原理 不同大小的微粒形成的散射光分布不同。不同大小的微粒形成的散射光分布不同。当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，散射光的强度在各个方向的分布均匀一致散射光的强度在各个方向的分布均匀一致，称，称RayleighaeRayleighae散射。散射。当微粒直径大于或等于入射光的波长时，前当微粒直径大于或等于入射光的波长时，前向散射光远远强于后向散射光向散射光远远强于后向散射光，称，称MileMile散射。散射。其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。原抗体复
8、合物的大小和多少密切相关。当固定检测角度与发射光的波长时，散射当固定检测角度与发射光的波长时，散射光的强度与复合物的含量成光的强度与复合物的含量成正比正比，即待测的抗，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。应选择应选择适当适当的光源强度、反应时间、测量角的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。度及光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、此外，还要选择适宜的离子强度、pHpH值等。值等。(二二)技术要求技术要求 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的一速率散射比浊法是抗原抗体结合反应
9、的一种动种动态测定方法。态测定方法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅检测仅12min即可完成。即可完成。(三三)速率散射比浊法速率散射比浊法（rate nephelometry）累计时间复合物产生总量产生速率51015202530354045505560813256015023
10、0300360415450480500512359080706055453020 抗原抗体复合物形成时间与速率的关系抗原抗体复合物形成时间与速率的关系 当抗体的浓度固定于一定范围时，当抗体的浓度固定于一定范围时，复合物复合物形成的速率峰值的高低与抗原的含量成正比，形成的速率峰值的高低与抗原的含量成正比，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。速率散射比浊法速率散射比浊法峰值出现的时间峰值出现的时间
11、与抗体浓与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。求，如严重脂血等即为不合格样本。技术要求技术要求测定光线通过反应混合液时，被其中IC反射的光的强度（turbidimetric immunoassay）测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度散射免疫比浊法检测的原理粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。第二节 自动化免疫比浊分析此外，要保证待测样本血清的性状符
12、合要求，如严重脂血等即为不合格样本。第二节 自动化免疫比浊分析第一节 免疫比浊的原理本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散射光速率变化大小与抗原浓度成正比。二、散射免疫比浊法将待检标本和抗原参考品作适当稀释。抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），使反应液出现浊度。双向琼脂扩散试验，两种受检抗原的性质完全相同时，沉淀线出现2 m），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。散射免疫比浊法检测的原理棋盘格法，又称方阵法，和 同时稀释，可一次完成 和 的滴定，并找出最
13、适比。应选择适当的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。(三三)方法评价方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质对抗体的质量要求很高。量要求很高。用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒粒（一般为（一般为0.2 m），），在遇到相应抗原时，胶乳在遇到相应抗原时，胶
14、乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚聚，使透射光和散射光即出现显著变化。，使透射光和散射光即出现显著变化。三、免疫胶乳比浊法三、免疫胶乳比浊法（一）（一）原理：原理：三、免疫胶乳比浊法三、免疫胶乳比浊法（一）（一）原理：原理：第二节第二节 自动化免疫比浊分析自动化免疫比浊分析（一）（一）BNBN特种蛋白分析测定系统特种蛋白分析测定系统 该系统的测定方法是透射免疫比浊法的该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种改良。以发光二极管作为光源，检测前一种改良。以发光二极管作为光源，检测前向角向角13132424度的散射光，然后利用硅化光电度的散射光，然
15、后利用硅化光电二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标准曲线进行比较，最后转换成待检物质与标准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓度。的浓度。一、主流免疫比浊设备概况一、主流免疫比浊设备概况1.测定原理测定原理 系统由分析仪、计算机、条码读取器、打系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印机四部分组成，其中印机四部分组成，其中分析仪分析仪是主要组成部分，是主要组成部分，包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。比色杯装置。2.仪器基本组成仪器基本组成BNBN、BN100特种蛋白分析分析系统特种蛋白分析分析系统
16、本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散射光速率变化大小与抗原浓度成正比。射光速率变化大小与抗原浓度成正比。速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。原的浓度。1.测定原理测定原理（二）（二）ARRAYARRAY分析系统分析系统 ARRAY ARRAY系统由分析仪、电脑处理系统、打印系统由分析仪、电脑处理系统、打印机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液系统、散射测浊仪、系统、散射测浊仪、
17、4040孔样本转盘、孔样本转盘、2020孔试孔试剂转盘、软盘驱动器等组成。剂转盘、软盘驱动器等组成。2.仪器基本组成仪器基本组成Array360Array360、IMMAGEIMMAGE特种蛋白分析分析系统特种蛋白分析分析系统二、免疫比浊分析的主要影响因素二、免疫比浊分析的主要影响因素1 1抗原抗体比例抗原抗体比例 抗原抗体比例要适当。抗原抗体比例要适当。2 2抗体的纯度与效价抗体的纯度与效价 诊断试剂应尽可能诊断试剂应尽可能选择高纯度与高效价的抗体。选择高纯度与高效价的抗体。3 3免疫复合物的大小及稳定性免疫复合物的大小及稳定性 溶液中免溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应疫复合物
18、颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相互聚集。该不容易相互聚集。4 4增聚剂增聚剂 利用增聚剂破坏抗原抗体的水化利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层，促进反应的进行。层，促进反应的进行。5.5.离子强度离子强度 PBSPBS是较好的反应液是较好的反应液。返回章目录返回章目录抗原过量检测抗原过量检测(1)抗体适当过量抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定对抗原过量进行阈值限定 免疫比浊分析法主要用于特定蛋白系列检测。如免免疫比浊分析法主要用于特定蛋白系列检测。如免疫球蛋白疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、链、免疫球蛋白亚链、免疫球蛋白亚类；补体类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白；血浆蛋白
19、如前白蛋白(PAB)、白蛋、白蛋白白(ALB)、1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白、结合珠蛋白(HP)、，、，C-反应蛋白反应蛋白(CRP)、载脂蛋白、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白脂蛋白(a)、类风湿因子、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。治疗性药物浓度等。三、临床应用三、临床应用小小 结结 经典的免疫沉淀反应通常是在抗原抗体经典的免疫沉淀反应通常是在抗原抗体反应的终点进行结果判断，存在操作繁琐、费反应的终点进行结果判断，存在操作繁琐
20、、费时、敏感度低及难以自动化等缺陷。自动化免时、敏感度低及难以自动化等缺陷。自动化免疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。目前，透射免疫比浊法和散射免疫比浊等方目前，透射免疫比浊法和散射免疫比浊等方法已常规运用于临床特定体液蛋白质的检测，相法已常规运用于临床特定体液蛋白质的检测，相关仪器已广泛应用于国内各级医院，成为临床免关仪器已广泛应用于国内各级医院，成为临床免疫检测的重要手段之一。疫检测的重要手段之一。返回章目录返回章目录思考题 1.名词解释：透射免疫比浊法、散射免疫比浊法 2.免疫比浊分析的基本原理是什么？有哪些类型？3.简述免疫比浊分析的主
21、要影响因素。抗体过剩期形成的免疫复合物测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的一种动态测定方法。火箭免疫电泳达到终点时应自动化免疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。测定光线通过反应混合液时，被其中IC反射的光的强度如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；第二节 自动化免疫比浊分析测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。一、选择题一、选择题 1.1.速率散射比浊法之所以能比传统的沉淀反应速率散射比浊法之所以能比传统的沉淀反应试验大大地缩短时间，主要是因为试验大大地缩短时
22、间，主要是因为 A.A.在抗原抗体反应的第一阶段判定结果在抗原抗体反应的第一阶段判定结果 B.B.不需复杂的仪器设备不需复杂的仪器设备 C.C.使用低浓度的琼脂或琼脂糖使用低浓度的琼脂或琼脂糖 D.D.反应的敏感度高反应的敏感度高 2.2.透射免疫比浊法透射免疫比浊法 A.A.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC反射的光的强度反射的光的强度 B.B.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC折射的光的强度折射的光的强度 C.C.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC吸收的光的强度吸收的光的强度
23、D.D.测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度 3.3.散射免疫比浊法检测的原理散射免疫比浊法检测的原理 A.A.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC反射的光的强度反射的光的强度 B.B.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC折射的光的强度折射的光的强度 C.C.测定光线通过反应混合液时，被其中测定光线通过反应混合液时，被其中ICIC吸收的光的强度吸收的光的强度 D.D.测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度 4.4.单向琼脂扩散法可用于单向
24、琼脂扩散法可用于 A.A.抗体定性抗体定性 B.B.抗体定量抗体定量 C.C.抗原定性抗原定性 D.D.抗原定量抗原定量 5.5.双向琼脂扩散试验，两种受检抗原的性质完全双向琼脂扩散试验，两种受检抗原的性质完全相同时，沉淀线出现相同时，沉淀线出现 A.A.二条直线相交叉二条直线相交叉 B.B.二条弧线完全融合二条弧线完全融合 C.C.二条弧线部分融合二条弧线部分融合 D.D.二条直线不连接二条直线不连接 6.6.火箭免疫电泳达到终点时应火箭免疫电泳达到终点时应 A.A.火箭峰呈云雾状火箭峰呈云雾状 B.B.火箭峰呈圆形火箭峰呈圆形 7.7.对于血清中数种蛋白质抗原成分的分析，常对于血清中数种蛋
25、白质抗原成分的分析，常可采用可采用 A.A.免疫电泳法免疫电泳法 B.B.单向扩散试验单向扩散试验 C.C.向扩散试验向扩散试验 D.D.火箭免疫电泳火箭免疫电泳 8.8.速率散射比浊法测定的散射信号值产生于速率散射比浊法测定的散射信号值产生于 A.A.单位时间内最大量的免疫复合物单位时间内最大量的免疫复合物 B.B.单位时间内免疫复合物形成的最快时间段单位时间内免疫复合物形成的最快时间段 C.C.单位时间内免疫复合物形成的最稳定期单位时间内免疫复合物形成的最稳定期 D.D.抗体过剩期形成的免疫复合物抗体过剩期形成的免疫复合物 二、填空题二、填空题 1.1.棋盘格法，又称方阵法，棋盘格法，又称方阵法，和和 同时稀释，可一次完成同时稀释，可一次完成 和和 的滴定，的滴定，并找出最适比。并找出最适比。2.2.免疫浊度测定的基本原理是抗原抗体在特殊免疫浊度测定的基本原理是抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成缓冲液中快速形成 ,使反应液出使反应液出现现 ，并可根据其推算出抗原或抗体的量。，并可根据其推算出抗原或抗体的量。
