1、高效液相色谱分析高效液相色谱分析基本要点：基本要点：1 1、了解高效液相色谱法的优点及适用范围；、了解高效液相色谱法的优点及适用范围；2 2、了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色、了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程；谱法基本流程；3 3、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；用范围；4 4、理解各种分离方式的原理及选择原则。、理解各种分离方式的原理及选择原则。第一节第一节 概述概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（法（HPLC）。）。液相色谱法开始阶段是
2、用大直径的玻璃管柱在室温和常液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。柱效低、时间长（常有几个小时）。HPLCHPLC是在经典液相是在经典液相色谱法的基础上，于色谱法的基础上，于6060年代后期引入了气相色谱理论而年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称
3、高压液相色谱法。又因分析速度快压输送流动相，故又称高压液相色谱法。又因分析速度快而称为高效液相色谱法。而称为高效液相色谱法。二、二、HPLC的特点和优点的特点和优点1、HPLC特点：特点：（1）高压）高压-压力可达压力可达150300Kg/cm2。色谱柱。色谱柱每米降压为每米降压为75Kg/cm2以上。以上。（2）高速）高速-流速为流速为0.110.0ml/min。（3）高效）高效-可达可达5000塔板每米。在一根柱中同时塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达分离成份可达100种。种。（4）高灵敏度）高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。同时消耗样品少。
4、2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：（1 1）速度快）速度快-通常分析一个样品在通常分析一个样品在151530min30min，有些样，有些样品甚至在品甚至在5min5min内即可完成。内即可完成。（2 2）分辨率高）分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。效果。（3 3）灵敏度高）灵敏度高-紫外检测器可达紫外检测器可达0.01ng0.01ng，荧光和电化学，荧光和电化学检测器可达检测器可达0.1pg0.1pg。（4 4）柱子可反复使用）柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合用一根色谱柱可分离不同的化合物。物
5、。（5 5）样品量少，容易回收）样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。可以收集单一组分或做制备。三、三、HPLC与与GC比较比较 HPLC的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性以及所用基本理论（塔配比、塔板高度、分离度、选择性以及所用基本理论（塔板理论与速率理论）与板理论与速率理论）与GC一致。但一致。但HPLCHPLC由于自身的一些由于自身的一些特点，与特点，与GCGC比还是有一定差别，主要有以下几方面：比还是有一定差别，主要有以下几方面：1 1、应用范围不
6、同、应用范围不同 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%20%。HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样
7、品均可检测，用途广泛，占有机物的可检测，用途广泛，占有机物的80%80%。GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。只与固定相有相互作用。2 2、流动相不同、流动相不同HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pHpH值也值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上对分离起到
8、调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选项择性。液体作为流动相也可以增大分离选项择性。3 3、操作条件不同、操作条件不同 GC：加温操作。加温操作。HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。四四HPLC主要类型主要类型 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。液相色谱方法并不能简单地归于这四类。类类型型主要分离机理主要分离机理主要分析对象或应用
9、领域主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附色谱吸附能，氢键吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备异构体分离、族分离，制备分配色谱分配色谱疏水分配作用疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱凝胶色谱溶质分子大小溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱库仑力库仑力无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析手性色谱手性色谱立体效应立体效应手性异构体分离，药物纯化手性异构体分离，药物纯化亲和色谱亲和色谱生化特异亲和力生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析第二节
10、第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素一、影响色谱峰形扩展的各种因素一、影响色谱峰形扩展的各种因素与与GC不同，不同，HPLC有其特点，因而其速率理论的表述方有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：式也有区别：ELSMMSMHHHHHH涡流扩散涡流扩散传质阻力传质阻力固定相固定相流动流动流动流动相相滞留流动滞留流动相相分子扩散分子扩散GC:HOLC:CuuBAH1 1、涡流扩散项、涡流扩散项HEHE=A=2dp式中式中,为填充不均匀因子，当固定相为为填充不均匀因子，当固定相为4050m时时,值为值为12；dp为填充固定相的平均粒径，颗粒小时，可降低为填充固定相
11、的平均粒径，颗粒小时，可降低A。2 2、分子扩散项、分子扩散项HL2MLrDBHuu式中，式中，r为柱中填料间的弯曲因子为柱中填料间的弯曲因子(r0.6)；DM为溶质在液体为溶质在液体流动相中的扩散系数流动相中的扩散系数(DM10-5cm2/s)；u为液体流动相在填充为液体流动相在填充柱中的平均线速柱中的平均线速(cms)。由于由于DM数值很小，因此数值很小，因此HL项对总板高的贡献也很小，在项对总板高的贡献也很小，在大多数情况下可假设大多数情况下可假设HL00。3 3、传质阻力项、传质阻力项C u可分为固定相传质阻力项可分为固定相传质阻力项Hs和流动相传质阻力项。和流动相传质阻力项。（1 1
12、）固定相传质阻力项固定相传质阻力项Hs对液液色谱可表示为：对液液色谱可表示为：22(1)fSLdkHqukD式中：式中：q为常数为常数q=2/3=2/3（对均匀液膜，对大孔固定相（对均匀液膜，对大孔固定相 q=1/2=1/2，对球形非多孔固定相，对球形非多孔固定相q=1/30=1/30）；）；k为容量因子；为容量因子；df为固定液液膜厚度；为固定液液膜厚度；DL为溶质在固定液中的扩散系数，为溶质在固定液中的扩散系数，cm2/s；u为液体流动相在柱中的平均线速，为液体流动相在柱中的平均线速，cm/s。对液固色谱可表示为：对液固色谱可表示为：22221(1)SadkkHtutukk式中：式中：ta
13、为样品分子在液体流动相中的平均停留时间；为样品分子在液体流动相中的平均停留时间；td为样品分子被吸附在固定相表面的平均停留时间；为样品分子被吸附在固定相表面的平均停留时间；k、u同前。同前。(2)(2)流动相传质阻力项流动相传质阻力项 又分为移动流动相的传质阻力项又分为移动流动相的传质阻力项HMM和滞留流动相的传和滞留流动相的传质阻力项质阻力项HSM移动流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：移动流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：2pMMMdHuD 式中，式中，为色谱柱的填充因子，对短的、内径粗的柱子为色谱柱的填充因子，对短的、内径粗的柱子数值较小；数值较小；dp为固定相的平均粒径；为固定相
14、的平均粒径；DM为溶质在液体流为溶质在液体流动相中的扩散系数动相中的扩散系数(DM10-5cm2/s)u同前。同前。滞留流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：滞留流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：2220(1)30(1)(1)pSMMdkHukrD式中，式中，为孔洞中滞留流动相在总流动相中占有的百分数；为孔洞中滞留流动相在总流动相中占有的百分数；r0 0为颗粒内部孔洞的弯曲因子；为颗粒内部孔洞的弯曲因子；k、dp、DM、u同前。同前。二、范第姆特方程的表达二、范第姆特方程的表达222222022(1)(1)30(1)(1)fpMpIMpMddrDkHdquuukDDdkukrD 在高效液相
15、色谱中，对液液分配色谱，范第姆特方程的在高效液相色谱中，对液液分配色谱，范第姆特方程的完整表达形式为：完整表达形式为：简化表达式为：简化表达式为：BHACuu三、方程的讨论三、方程的讨论HPLC与与GC的的H-u曲线比较：曲线比较：1、在、在HPLC中，由于使用固定相中，由于使用固定相与流动相与与流动相与GC不同，不同，H-u曲线的曲线的最低点远低于最低点远低于GC。2 2、HPLC中，流动相粘度远远中，流动相粘度远远 4 4、由低的、由低的uopt值可看出值可看出H-u曲线具有平稳的斜率，表明采曲线具有平稳的斜率，表明采用高的液体流动相流速时，色谱柱效无明显的损失，这也用高的液体流动相流速时
16、，色谱柱效无明显的损失，这也是是HPLC的快速分离的基础。的快速分离的基础。3 3、由低的、由低的Hmin值可看出，值可看出，HPLC色谱柱要比色谱柱要比GC填充柱有填充柱有更高的柱效。更高的柱效。高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小。高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小。B/uuDrdkkuDduDdkkqdHCuAHMpMpIfp0222222)1)(1(30)1()1(2 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：分析，一般可采用以下措施：进样时间要短。进样时间要短。填料粒度要小。填料粒度要小。改善传质过程。改善传质过程
17、。过高的吸附作用力可导致严重的峰过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。适当的流速。适当的流速。以以H对对u作作图，则有一最佳线速度图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，在此线速度时，H最小。一般最小。一般在液相色谱中，在液相色谱中，uopt很小（大很小（大约约0.030.1mm/s），在这样），在这样的线速度下分析样品需要很长的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。的条件下操作。较小的检测器死体积。较小的检测器死体积。第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 典型的高效液相色谱仪是由典型的
18、高效液相色谱仪是由高压输液系统高压输液系统、进样系统进样系统、分离系统分离系统、检测系统检测系统和和色谱数据处理系统色谱数据处理系统（色谱工作站）（色谱工作站）五个基本部分和相关辅助部件构成。五个基本部分和相关辅助部件构成。一、一、高压输液泵及梯度洗脱装置高压输液泵及梯度洗脱装置1 1、高压输液泵、高压输液泵 高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。接关系到分析结果的重复性和准确性。基本要求：基本要求：
19、流量稳定，其流量稳定，其RSD应应0.5%，这对定性定，这对定性定量的准确性至关重要；流量准确可调，量的准确性至关重要；流量准确可调，0.110ml/min，输出压力高，一般应能达到输出压力高，一般应能达到150300kg/cm2；液流稳；液流稳定，无脉动；定，无脉动；死体积小，要求小于死体积小，要求小于0.5ml。密封性能好，。密封性能好，耐腐蚀。耐腐蚀。泵的使用及注意事项：泵的使用及注意事项：防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先过滤除去
20、流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连预先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接砂滤棒。接砂滤棒。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此
21、，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。水）。2 2、梯度洗脱装置、梯度洗脱装置 梯度洗脱类似梯度洗脱类似GCGC的程序升温。是使流动相中含有两种的程序升温。是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容
22、量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。则会使高压密封环变形，产生漏液。流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流流动相应该先脱气，以免在泵内产
23、生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。泵就无法正常工作。内梯度：内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外梯度：外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必
24、须充分重视：变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。小心。梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认重现性。
25、进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。止混合时产生气泡。混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意
26、防止梯度洗脱过程中压水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让其恢复到初始状态。需让10301030倍柱容积的初始流动相流倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。二、进样装置二、进样装置 通常使用耐高压的六通阀进样装置。通常使用耐高压的六通阀进样装置。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种：六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液
27、法两种：用部分装液法用部分装液法 进样量应不大于定量环体积的进样量应不大于定量环体积的50%50%（最多（最多7575），并要），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。峰展宽。用完全装液法用完全装液法 进样量应不小于定量环体积的进样量应不小于定量环体积的5 51010倍（最少倍（最少3 3倍），倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。
28、保进样的准确度及重复性。六通阀使用注意事项：六通阀使用注意事项：样品溶液进样前必须用样品溶液进样前必须用0.45nm0.45nm滤膜过滤，以减少微滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用
29、能溶解样品的后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。溶剂冲洗，再用水冲洗。三、色谱柱三、色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。用条件有关。柱效以理论塔板数计，大约可达柱效以理论塔板数计，大约可达516万万/m。对于一般。对于一般的分析只需的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难分离物质对则可采用高达即可；对于较难分离物质对
30、则可采用高达2万的柱子，万的柱子，因此一般因此一般1030cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。的需要。柱子内径一般为柱子内径一般为16mm。常用的标准柱型是内径为。常用的标准柱型是内径为4.6或或3.9mm，长度为，长度为1530cm的直形不锈钢柱。填料的直形不锈钢柱。填料颗粒度颗粒度510m。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过
31、程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。要注意下列问题，以维护色谱柱。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，进样时阀的转动不能过缓。调节流速时应该缓慢进行，进样时阀的转动不能过缓。应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。直接从有机溶剂改变为
32、全部是水，反之亦然。一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。迅速降低柱效。选择使用适宜的流动相（尤其是选择使用适宜的流动相（尤其是pHpH），以避免固定相），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶先被硅胶“饱和饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。，避免分
33、析柱中的硅胶基质被溶解。避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。以而且应该经常更换。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的溶剂逐
34、渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的2020倍左倍左右，即常规分析需要右，即常规分析需要505075ml75ml。四、检测器四、检测器作用：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的作用：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。组成和含量变化的装置。目前最常用的检测器主要目前最常用的检测器主要有：紫外紫外-可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器示差折光检测器示差折光检测器电化学检测器电化学检测器质谱检测器质谱检测器1 1、紫外吸收检测器、紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它中应用最广泛的检测器。它灵敏度高，线性范围宽，对流速和温
35、度变化不敏感，可用灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分紫外吸收波长处没有吸收。长不同，在被测组分紫外吸收波长处没有吸收。光源光源检测室检测室光栅光栅二极管阵二极管阵列检测器列检测器2 2、荧光检测器、荧光检测器 是一种高灵敏度、有选择是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化
36、学衍生化光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可光检测。其最小检测浓度可达达0.10.1ngml，适用于痕量，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约器的灵敏度比紫外检测器约高高2 2个数量级，但其线性范个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽围不如紫外检测器宽。荧光检测器结构示意图光源光源检测器检测器滤光片滤光片检测室检测室3.3.示差折光检测器示差折光检测器 是基于连续测定样品流路是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从化来测定样品含量的。光
37、从一种介质进入另一种介质时，一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓围内检测器的输出与溶质浓度成正比。度成正比。对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。器检测。电化学检测器主
38、要有安培、极谱、库仑、电位、电导等电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。子色谱中应用最多。电导仪电导仪电极电极电电极极电导检测器电导检测器4 4、电化学检测器、电化学检测器
39、5 5、与检测器有关的故障及其排除、与检测器有关的故障及其排除 （1 1）流动池内有气泡）流动池内有气泡 如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状果气泡较大，则会在基线上出现许多线状 峰峰，这是由于，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增
40、大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。以免流动池破裂。（2 2）流动池被污染）流动池被污染 无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用性；如
41、果污染严重，就需要依次采用1mol/L1mol/L硝酸、水和硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。（3 3）光源灯出现故障）光源灯出现故障 紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。（4 4）倒峰）倒峰 倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后
42、即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引
43、起的。的。第三节第三节液相色谱分离原理液相色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。对色谱法及分子排阻色谱法。1 1、液固色谱法、液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，吸附解吸附的平
44、衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度粒度5 50 0m。适用于分离分子量适用于分离分子量20020010001000的组分，大多数用于非离的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。异构体。2 2液液色谱法液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分分离过程是一
45、个分配平衡过程。配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如采用的是化学键合固定相，如C18C18、C8C8、
46、氨基柱、氰基柱、氨基柱、氰基柱和苯基柱。和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法谱法(NPC)(NPC)和反相色谱法和反相色谱法(RPC)(RPC)。正相色谱法：正相色谱法：采用极性固定相采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动；流动相为相对非极性的疏水性溶剂相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较
47、强的化常用于分离中等极性和极性较强的化合物合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法：反相色谱法：一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如C C1818、C C8 8）；流动相为水或缓）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和适用于分离非极性和极性较弱的化合物。极性较弱的化合物。RPCRPC在现代液相色谱中应用最为广泛，在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个据统计，它占整个HPLC
48、HPLC应用的应用的80%80%左右。左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pHpH值。值。正相色谱法与反相色谱法比较正相色谱法与反相色谱法比较 正相色谱法正相色谱法 反相色谱法反相色谱法 固定相极性固定相极性高中高中中低中低 流动相极性流动相极性低中低中中高中高 组分洗脱次序组分洗脱次序极性小先洗出极性小先洗出极性大先洗出极性大先洗出 从上
49、面可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱从上面可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3 3、离子交换色谱法、离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动是树脂上可电离离子与流动相中
50、具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的基团作用强弱有关外，它还受流动相的pHpH值和离子强度值和离子强度影响。影响。pHpH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固
