1、多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCRPCR技术技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNADNA序序列的方法，故又称为列的方法，故又称为DNADNA体外扩增技术体外扩增技术。课题背景课题背景PCRPCR技术能迅速扩增技术能迅速扩增DNADNA片段，原因是：片段，原因是：DNADNA分子具有分子具有结构。结构。DNADNA复制时遵循复制时遵循原则。原则。规则的双螺旋规则的双螺旋碱基互补配对碱基互补配对基础知识基础知识1 1、DNADNA的基本单位：的基本单位：脱氧核苷酸脱氧核苷酸碱基碱基脱氧核糖P一、一、DNADNA的结构的结构ATGC2、化学结构：、化学结构：DN
2、ADNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链（即一条链为（即一条链为3535，另一条链为，另一条链为5353）盘）盘旋而成的规则双螺旋结构。旋而成的规则双螺旋结构。553312543磷酸基团（在磷酸基团（在 5 的位置上）的位置上）2 2、细胞内、细胞内DNADNA复制所需条件复制所需条件：模板：模板：原料：原料：酶：酶：能量：能量：引物：引物：DNADNA的两条链的两条链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶DNADNAATPATP二、二、DNA复制：复制：1、复制方式：、复制方式：3 3、细胞内、细胞内DNADNA复制特点复
3、制特点：边解旋变复制边解旋变复制半保留复制半保留复制DNA复制的方向复制的方向引物引物DNA母链母链DNADNA的复制方向的复制方向总是从总是从子链的子链的55端向端向33端端延伸延伸引物从模板链引物从模板链33端结合端结合DNA起始端起始端 3 5 DNA聚合酶能不能从头开始DNA复制？DNADNA聚合酶聚合酶只能从引物只能从引物3 3 端延伸端延伸DNADNA链（合成链（合成子链）。因为子链）。因为DNADNA聚合酶聚合酶只能将新的核苷酸加只能将新的核苷酸加到已有的到已有的DNADNA双链上，双链上，所以所以DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3 5 从中选出适合的引物进行从中选出适合
4、的引物进行PCR:PCR:(1)CCTAGA (1)CCTAGA (2)GTTCGC(2)GTTCGC(3)AAAGT (3)AAAGT (4)TTTCA(4)TTTCA 3 5 5 3 结论：结论：1 1、引物结合在母链的、引物结合在母链的33端。端。2 2、复制不是从头开始。、复制不是从头开始。3 3、DNADNA聚合酶从引物聚合酶从引物33端开始结合上去端开始结合上去4 4、子链、子链DNADNA延伸的方向从延伸的方向从55到到331 1、PCRPCR（多聚酶链式反应）技术：（多聚酶链式反应）技术：体外模拟体外模拟DNADNA复制复制的技术。的技术。2 2、原理：、原理：二、二、PCRP
5、CR原理原理利用了利用了DNADNA的热变性的热变性原理，通过控制温度原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。来控制双链的解聚与结合。DNADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）复性（复性（缓慢缓慢冷却）冷却）重复重复3030次次1 1 步骤：变性步骤：变性 复性复性 延伸延伸三三 PCRPCR的反应过程的反应过程90 90 以上以上50 50 左右左右72 72 左右左右2 2 体外体外PCRPCR扩增扩增DNADNA的条件：的条件：模板：模板：原料：原料：酶：酶：2 2种引物：种引物：DNADNA的两条链的两条链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸TaqDNATa
6、qDNA聚合酶聚合酶引物引物、引物、引物在一定的缓冲液中进行在一定的缓冲液中进行严格控制温度严格控制温度模板DNA 3 3 5 5 三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 50引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 95三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 72Taq酶Taq酶子链子链子链子链第第1 1轮结束轮结束第第2 2轮开始轮开始三三 PCRPCR的反应过程的反应过程PCR技术的操作过程1 1、上一次循环的产物作为下一次循环模板上一次循环的产物作为下一次循环模板2 2、DNADNA聚合酶只能特异性地复制
7、聚合酶只能特异性地复制处于两个引处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈呈指数扩增指数扩增。PCRPCR的反应过程总结：的反应过程总结：（2 2n n）细胞内细胞内DNA复制与体外复制与体外PCR的技术区别：的技术区别：细胞内复制细胞内复制体外体外PCRPCR技术技术解旋解旋解旋解旋酶酶ATPATP作用下，作用下，部分解开部分解开高温，全部解开高温，全部解开，不，不需解旋酶需解旋酶引物引物2 2种种2 2种种DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶（细胞自身聚合酶（细胞自身的，不耐高温）的，不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶（耐高聚合酶（耐高温）温）复制特点复制特点半保留复制，半保留复制，边解旋边解旋边复制边复制。半保留复制，半保留复制，完全解完全解旋后复制旋后复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 33端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 33端延伸端延伸四四 PCRPCR反应的实验操作及操作提示反应的实验操作及操作提示PCR反应反应（无（无PCR仪时）仪时）第一轮第一轮第二轮第二轮第三轮第三轮
