1、曲靖市曲靖市“三名三名”名师工作室名师工作室 吴吴 谦谦华东理工大学华东理工大学 国家生化工程技术研究中心国家生化工程技术研究中心(上海上海)王永红王永红2011.11.242011.11.24微生物菌种高通量筛选技术与装置微生物菌种高通量筛选技术与装置内容提纲内容提纲 高通量筛选在微生物育种中的重要意义高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术与装备菌种高通量筛选技术与装备国际进展国际进展 高通量筛选技术应用示范高通量筛选技术应用示范高通量筛选在微生物育种中的重要意义高通量筛选在微生物育种中的重要意义 1、菌种是发酵技术的源头菌种是发酵技术的源头2、菌种是发酵技术的核心之核心、菌
2、种是发酵技术的核心之核心3、菌种提高不增加设备材料投入、菌种提高不增加设备材料投入 菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现青霉素：5万12万 u/ml（国内）8万20万 u/ml（国外）红霉素：50008000/10000 u/ml（国内）1000015000 u/ml（国外）阿维菌素：40008400 u/ml（国内）10000 u/ml 以上（国外）案案例例 育种工作中两大任务：突变突变与与筛选筛选高通量筛选在微生物育种中的重要意义高通量筛选在微生物育种中的重要意义变异变异菌种库筛选筛选目标株自然选育人工诱变推理选育杂交育种基因工程代谢工程各种组学系统
3、生物学合成生物学特异性模型筛选量突变仅是前提筛选才是关键 我国现有菌种筛选仪器装备与技术国际相比存在巨大差距 我国：传统方法，筛选方式半个世纪没有明显改进 国际：高通量筛选技术(High throughput screening,HTS)高通量筛选在微生物育种中的重要意义高通量筛选在微生物育种中的重要意义 Traditional screeningHigh throughput screeningFlask/tube(single)Microtiter plate(12、24、48、96、384、1536)Volume(10-50 ml)Volume(10-500 l)Screen 20-50
4、/week/labScreen 1000-10000/week/labManual AutomaticLaborious Laborsaving Series Parallel 内容提纲内容提纲 高通量筛选在微生物育种中的重要意高通量筛选在微生物育种中的重要意义义 菌种高通量筛选技术与装备国际进展菌种高通量筛选技术与装备国际进展 高通量筛选技术应用示范高通量筛选技术应用示范1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的发现p56名科学家、10万份土样、历时1年p25%市场1984年，Pfizer提出Automation Project.1990年，在Nagoya,Japan实施p1
5、万株份/周高通量筛选技术的起源高通量筛选技术的起源 微生物菌种筛选一般流程 概率事件菌种高通量筛选技术与装备国际进展菌种高通量筛选技术与装备国际进展通量限制步骤诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛验证验证工业应用工业应用接种到接种到多孔板多孔板倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测出发菌株出发菌株微生物菌种筛选仪器装备发展趋势：自动化、微型化、高通量 培养基灭菌、分装；倒平板；挑取单菌落、接种；培养；目的产物抽提；测定；数据收集处理等过程 单元自动化与系统集成自动化（通量匹配）菌种高通量筛选技术与装备国际进展菌种高通量筛选技术与装备国际进展
6、Filling Unit分装速率：400-1200 dishes/h分装量：4-45 ml/0.5-0.6 sec平动规格：直径92-98 mm可调高度15-21 mm可调灭菌方式：253.7 nm 紫外线灭菌尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kg Stacking Unit堆叠速率：可调，与输送机自动配合。堆叠高度：2-15板平皿，可调堆叠桌面：500 500 mm可扩充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛验证验证工业应用工业应用接种到接种到多孔板多孔板倒平板倒
7、平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测出发菌株出发菌株全自动培养基分装系统全自动培养基分装系统750皿/小时自动灭菌培养基制备机自动灭菌培养基制备机 出发株出发株诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛工艺工艺放大放大接种接种倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测自动细菌平板稀释仪自动细菌平板稀释仪 4600个克隆/小时诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛验证验证工业应用工业应用接种到接种到多孔板多孔板倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测出发菌株出发菌株培养培养出发株出发株诱
8、变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛工艺工艺放大放大接种接种倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测出发株出发株诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛工艺工艺放大放大接种接种倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测培养基分装培养基分装传统方法传统方法诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛验证验证工业应用工业应用接种到接种到多孔板多孔板倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测出发菌株出发菌株高通量方法：高通量方法：96、384、1536/min传统
9、方法：传统方法：1-2/min（分光光度计）（分光光度计）1/15-30min（HPLC）传统方法传统方法出发株出发株诱变等诱变等10倍稀释倍稀释涂平板涂平板单菌落单菌落初筛初筛复筛复筛验证验证放大放大接种接种倒平板倒平板培养基培养基保藏保藏活化活化前处理前处理检测检测培养基分装培养基分装1 微孔板式反应器微孔板式反应器2 微流控式芯片实验室微流控式芯片实验室3 摇瓶形式的微型反应器摇瓶形式的微型反应器1 232056 valves,256 compartments containing bacterial expressing an enzyme24个，个，5ml12个，个，30ml24个，
10、个，1ml多通道多参数多通道多参数微型反应器微型反应器 动物细胞培养用微型反应器左图4.92.32.2 m，整个箱体有温湿度控制，箱体内，条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、光度计、离心机、冷藏室等。平行地实现样品准备、运行、监控768个（16个48孔板）。系统集成自动化：四个层次系统集成自动化：四个层次Orbitor工作站工作站 重量轻重量轻 only 55 lbs.只有25公斤 高可靠性高可靠性 Collision detection&recovery冲突检测与恢复 Plate sensing in the gripper微孔板传感器 Servo gripper does n
11、ot drop a plate when the power goes out!伺服抓板手-即使停电也不会让一个板子掉落 运送一块板子只需运送一块板子只需4秒钟秒钟 Bi-directional telescoping arm双向伸缩手 Unlimited 3600 rotation无限360度转动 No hard stops无急停死角 Motion blending运动混合 smooth movements平稳移动Orbitor结构剖解1.Bi-directional telescoping arm双向伸缩抓板手2.Rotating base旋转平台3.Internal re-grip内部固
12、定装置4.Hotel mount x4 板子堆栈*41.4.3.2.操作灵活性 PC driven微机控制No controller required无需其它控制装置 Add-on storage capability可搭配存储能力 Small footprint小的占地空间和轨迹 Feed up to 4 instruments with ease可连接4台仪器 Fits within a wide variety of bio safety cabinets适应多种型号的生物安全柜内容提纲内容提纲 高通量筛选在微生物育种中的重要高通量筛选在微生物育种中的重要意义意义 菌种高通量筛选技术国际
13、进展菌种高通量筛选技术国际进展 高通量筛选技术应用示范高通量筛选技术应用示范高通量筛选技术高通量筛选技术Scale upScale down微型化微型化高通量高通量标准化标准化对高通量筛选技术存在认识上的对高通量筛选技术存在认识上的误区误区 认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题；对操作条件的平行性没有足够的认识 仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移问题 对标准化重于最优化的认识不足 高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段菌种高通量筛选技术组成菌种高通量筛选技术组成高通量高通量前处理技术前处理技术高通量高通量培养技术培养技术高通量液体高通量液体处理技术处理技术高通量高通
14、量转接种技术转接种技术高通量克隆高通量克隆制备技术制备技术菌种库菌种库管理技术管理技术高通量数据高通量数据管理技术管理技术高通量分析高通量分析检测技术检测技术菌种高通量菌种高通量筛选技术筛选技术分析测试分析测试高通量培养高通量培养菌种资源菌种资源菌种高通量筛选技术菌种高通量筛选技术通量匹配通量匹配限制瓶颈在不断克服和转移限制瓶颈在不断克服和转移菌种高通量筛选技术F 菌种高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机整合和合理匹配红霉素生产菌株的微型化培养及红霉素生产菌株的微型化培养及分析分析菌落库菌落库孔板培养孔板培养离心离心移液移液检测检测高通量高通量微型化培养 就摇瓶与微孔板之间的生理发酵参数和动
15、力学参数进行了研究，以证实微型化培养方法的可行性，为红霉素产生菌高通量筛选奠定了基础。微型化培养-动力学参数比较动力学参数比较t1t2t3t4t5t6摇瓶摇瓶3031282920342237283012孔板孔板(2.5ml)897861859911932887摇瓶摇瓶12孔微孔板孔微孔板kLa（h-1）10528842.1 氧气传递系数氧气传递系数2.2物料混合物料混合流场特性流场特性OTR 与混合三、三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础国家生化工程中心的高通量筛选工作基础微型化培养-发酵参数比较发酵参数比较 2.3 生物效价生物效价2.4 总糖的对应性实验总糖的对应性实验 微型化培养-发
16、酵参数比较发酵参数比较 2.5 还原糖的对应性实验还原糖的对应性实验2.6生物量生物量微型化培养-装置图种子（挖块）种子（挖块）发酵（孔径发酵（孔径2cm）微型化分析 建立与微型化发酵培养配套的检测方法，才能真正意义上实现筛选的高通量。生物检测法生物检测法 化学检测法化学检测法生物检测法生物检测法生物检定法又分管碟法和比浊法两种，管碟法是最常用的生物检定法，也是我国2005版之前药典收录的唯一一种微生物检定法。与管碟法比较，比浊法具有快速(检验仅需34 h)、易于操作、采用液体培养法、无扩散因素影响、灵敏度高和精密度较好等优点，适用于绝大部分抗生素和含抗生素样品的含量测定。化学检测法化学检测法
17、红霉素分子在酸性条件下水解生成黄色络合物，此颜色与含量成正比，符合朗格尔比色定律。红霉素检测方法红霉素检测方法微型化分析-生物检测法生物检测法微量比浊法测定红霉素生物效价的可行性微量比浊法测定红霉素生物效价的可行性 微型化分析-生物检测法生物检测法微型化分析-生物检测法生物检测法123456789101112A0.3300.3310.3310.3300.3310.3300.3310.3320.3310.3310.3310.330B0.3320.3330.3330.3320.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3320.332C0.3310.3320.3320.3320.
18、3320.3320.3330.3330.3320.3320.3320.331D0.3320.3330.3340.3330.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3330.332E0.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3340.3330.3330.3340.3330.332F0.3330.3340.3340.3340.3330.3330.3340.3360.3340.3330.3330.333G0.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3340.3340.3340.3340.3340.333H0.3330.3330.3330.
19、3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.333准确度：准确度：1.5%精密度：精密度：0.005 相对标准偏差相对标准偏差(RSD)：1.48%检验检验96孔板的准确度与精密度孔板的准确度与精密度 微型化分析-化学检测法检测法红霉素化学效价测定结果比较红霉素化学效价测定结果比较微型化分析-化学检测法检测法样品前处理对红霉素效价检测的影响分析样品前处理对红霉素效价检测的影响分析微型化分析-化学检测法检测法高通量化学检测方法验证高通量化学检测方法验证标准品加入法是在样品溶液中加入一系列梯度标准溶液进行显色测定，然后按照绘制标准曲线的步骤测定吸光度,绘制吸光度
20、-加入浓度曲线,用外推法求得样品溶液的浓度。两条直线切入横座标上所间的距离，即是样品中红霉素的化学效价，为47.8/ml，标准曲线法测定的结果为48.02/ml，相对标准偏差为0.00324Y1=0.0046X-0.0164Y2=0.0046X+0.2202高通量（微型化）抗生素效价分析方法高通量（微型化）抗生素效价分析方法生物效价高通量分析方法：生物效价高通量分析方法：基于比浊法原理设计生物效价高通量分析方法，使分析时间从20多小时缩短到4小时，分析样品量从1ml降到10ul，鉴定菌培养基从30ml降到90ul，一次检测样品数量可达到成百上千份，而且仅需1人操作，传统生物效价分析，每天每人分
21、析样品数量50份左右。化学效价高通量分析方法：化学效价高通量分析方法：开发了可以与自动化液体处理工作站相匹配的微量化化学分析路线，筛选通量更高，样品检测体积更小，反应体积从20ml降到500ul，检测体积从5ml降到100ul，分析时间更短，1小时之内完成上千份样品分析。微型化平台应用单菌落培养单菌落培养高通量培养技术固体培养和菌种保藏固体培养和菌种保藏可灭菌、重复使用寿命长、成本低、易清洗、能统一标准、防交叉污染、透气性好、防止水分蒸发孔板盖孔板盖微孔板固定架多通道可调深孔板取样适配器专用菌落琼脂柱打孔器专用菌落琼脂柱打孔器微型化平台应用 对诱变后对诱变后96个菌株分别进行摇瓶培养和微型化培
22、养，个菌株分别进行摇瓶培养和微型化培养，5天后测天后测定其生物活性，结果如图。定其生物活性，结果如图。微型化平台应用微型化平台应用总结：高通量筛选技术的优势（1）操作平行性 结果可比性 效率(一周到一个月完成常规方法一年的工作量)成本：人力、时间、空间、经济总结：高通量筛选技术的优势（2）1.高产菌株的筛选 数量性状：1多关系，无模型，依靠筛选数量 如：赖氨酸高产菌株筛选质量性状：01关系，有模型，无需庞大筛选数量。如：赖氨酸缺陷菌株筛选其他：各种氨基酸、有机酸、维生素、抗生素、生物基产品等高产筛选总结：高通量筛选技术的优势（3）2.发酵原材料（培养基）的生物检验 直接检验原材料的应用效果 精细调节原材料的配比和用量 不同原材料与菌株的对应关系特点：建立原材料数据库和菌株数据库 长期性、基础性工作
