1、高效液相色谱 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）是）是20世纪世纪60年年代末代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更率高、灵敏度高、操作自
2、动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：进行比较：HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3min-1.如分离苯的羟基化合物，如分离苯的羟基化合物，7个组分只需个组分只需1min就可完成。就可完成。对氨基酸分离，用经典
3、色谱法，柱长约对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径，柱径0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm3h-1，需用，需用20多小时才能分离出多小时才能分离出20种氨基酸；而用种氨基酸；而用HPLC，只需，只需lh之内即可完成。之内即可完成。又如用又如用25cm0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采的柱，采用梯度洗脱，可在不到用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分个组分.(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近。对于占有
4、机物总数近80的的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用要采用HPLC进行分离和分析。进行分离和分析。(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制此，
5、流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。极大方便。(3)GC一般都在较高温度下进行的，而一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可法则经常可在室温条件下工作。在室温条件下工作。总之，总之，HPLC是吸取了是吸取了GC与经典液相色谱优点，与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、大意
6、义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。离和分析。HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。和和GC一样，一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。分离系统也由固定相和流动相组成。其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱相是各种溶剂。被分离混合
7、物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。的大小，决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交
8、换色谱以及分子排液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。阻色谱等类型。首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。此
9、外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由、等组成。等组成。核心部件核心部件。压力：压力：150350105 Pa。应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒
10、流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。恒流泵特点：恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵特点：恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。应用最多的是机械往复泵。输液泵按
11、工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有中又有螺旋传动注射泵螺旋传动注射泵、单活塞往复泵单活塞往复泵、双活塞往复泵双活塞往复泵和和往复式隔膜泵往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。几种输液泵的基本性能见下表。双活塞往复泵：双活塞往复泵：如下如下图图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单
12、向阀打开吸端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如的排液特性如图图b所示，即具有稳定的输出流量，这所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。双活塞往复泵的输液双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。流量比单活塞泵小得多。优点：优点：不必使用消除脉冲的
13、不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗。的压力消耗。缺点：缺点：设备成本较高，流量设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。调节也比单活塞泵复杂。双活塞往复泵的构造和排液特性双活塞往复泵的构造和排液特性单流路真空脱气装置的原理单流路真空脱气装置的原理高压梯度装置结构四元低压梯度系统结构 利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。一台高压泵一台高压泵,通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性
14、的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。HPLC柱比柱比GC柱短得多（约柱短得多（约530cm），所以柱外），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱外展宽可分柱前柱前和和柱后柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此展宽的主要因素，因此HPLC法中对进样技术要求较严。法中对进样技术要求较严。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀
15、流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。进样装置。结构如图所示：结构如图所示：色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管柱管与与固定相固定相两部分。两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般色谱柱长530cm，内径为，内径为45mm，凝胶色谱，凝胶色谱柱内径柱内径312mm，制备柱内径较大，可达，制备柱内径较大，可达25mm 以上。以上。一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个
16、前置柱前置柱，前置柱内填充物和分，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。保证分离柱的性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后
17、，即可备用。液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。一般柱体为直型不锈钢管，内径一般柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。应用最广，对大部分有机化合物应用最广，对大部分有机化合物有响应。其特点：有响应。其特点：灵敏度高；灵敏度高；线形范围高；线形范围高；流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm，容积，容积 8L）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重
18、要进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（优点：优点：高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B、黄曲、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；、氨基酸、甾类化合物等有响应；测量溶剂电导率，特别适合于离子溶液。测量溶剂电导率，特别适合于离子溶液。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发
19、室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质粒大小和数量有关
20、，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。液液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相。固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相。吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的吸附剂通常
21、是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。不同来进行分离的。固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度
22、的保被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂，于是在留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂，于是在固定相表面发生竞争吸附固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡时达平衡时,有有 nadnadadSXSXK 其中其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。上保留强，难于洗脱。Kad值小值小,则保留值弱，易于洗脱。则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线值可通过吸附等温线数据求出。数据求出。适用于分离相对分子质量中等的
23、油溶性试样，对适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；非线形等温吸附常引起峰的拖尾；在液在液-液色谱中液色谱中,流动相和固定相都是液体（互不相流动相和固定相都是液体（互不相溶）。它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极溶）。它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。型的化合物。液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是液液分配色谱的分离原理基本与液液萃
24、取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。同的分配系数。liquid-liquid partition chromatography 所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不
25、同的固定液即固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液，氧二丙睛氧二丙睛，中等极性的，中等极性的聚乙二醇聚乙二醇，非极性的，非极性的角鲨烷角鲨烷等。等。chemical bonded partition chromatography,它是最先用于液它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：SiOHROHSiORH20由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性的传质特性,但这些酯化
26、过的硅胶填料易水解且受热不稳但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。制备反应如下制备反应如下 共价键健合固定相不易水解，且热稳定较硅酸酯好。共价键健合固定相不易水解，且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在在48范围内范围内.OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2制备反应如下：制备反应如下：OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+HCl 这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有这类键
27、会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在机溶剂的优点。能在70以下，以下，pH=28范围内正常工范围内正常工作，应用较广泛作，应用较广泛.此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶胶C18H37、硅胶苯基等；硅胶苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物
28、；也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。的优点。关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作疏溶剂作用理论用理论来解释。来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，这种这种“分子毛分子毛”有较
29、强有较强的疏水特性。的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用，见下图。显然，两种它离开固定相，并减小其保留作用，见下图。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。作用力之差，决定了分子在色谱中的保
30、留行为。此法是以极性的有机基团，此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腊等）为流动相，分离极性化合物腊等）为流动相，分离极性化合物。此时，此时，组分的分配比组分的分配比k值随其极性的增加而增大，值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。但随流动相极性的增加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的
31、化合物。化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一合各种离子交换基团，如一SO3H 一一CH2NH2、COOH、一、一CH2N（CH3）等时，就形成了离子性键合相色）等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交分离原理与离子交换色谱类同。换色谱类同。键合相色谱的键合相色谱的最大优点最大优点：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此
32、外，由于键类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有统计，在高效液相色谱法中，约有80的分离问题是用的分离问题是用键合相色谱法解决。键合相色谱法解决。此法的此法的最大缺点最大缺点：不能用于酸、碱度过大或存在氧不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。化剂的缓冲溶液作流动相的体系。如何根据样品极性种类来选择化学键合的固定相，如何根据样品极性种类来选择化学键合的固定相，见下表。见下表。ion-exchange chromatography 此法是利用离
33、子交换原理和液相色谱技术的结合此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。亦可用于有机物的分离。例如氨基酸、核酸、蛋例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，白质等生物大分子。因此，应用范围较广。应用范围较广。离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力
34、的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阳离子交换：RSO3-H+M+RSO3-M+H+阴离子交换：阴离子交换：RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+Cl-一般形式：一般形式：RAB RBA 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常
35、数（离子交换反应的选择系数）：的选择系数）：式中式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（和试样离子（B）的浓度，）的浓度，A、B则代表它们在溶液中则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于对于A型树脂亲和力的大小：型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明越大，说明B离子交离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子离子电荷越大，水合离子半径越小，电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。值就越大。rrABABABK/
36、对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：值按以下顺序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为：二价离子的顺序为：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：顺序为：ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤
37、维素和硅胶。而离子交换剂又合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。强弱之分。常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为径约为520m，有微孔型和大孔型之分。，有微孔型和大孔型之分。它是在直径约对它是在直径约对30m的固体情性核上，凝聚的固体情性核上，凝聚12m厚的树脂层。厚的树脂层。它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在它是在固体情性核上，覆
38、盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。上面涂一层很薄的离子交换树脂。它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，其载体是多孔微粒硅胶。是键合微粒载体型，其载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。快速分离。离子交换色谱法所用流动相大都
39、是一定离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和的种类、浓度和pH值可控制值可控制k值，改变选择性。值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。附能力，从而降低其在固定相上的保留值。对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子滞留次序为：对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子滞留次序为：柠檬酸离子柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3C
40、OO-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：阳离子的滞留次序大为：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十十 但差别不如阴离子明显。关于但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不值的影响，要视不同情况而定。同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的可通过改变流动相的pH值来控制。值来控制。增大增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；值会使酸的电离度增加，使碱的电离度
41、减少；降低降低pH值，其结果相反。值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。的保留增大。ion pair chromatography 离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。它是离子对革取技术与色谱法相结合的产物。极好方法。它是离子对革取技术与色谱法相结合的产物。在在20世纪世纪70年代中期，年代中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展。后来，这种方法得到十分迅速的发展。离子对色谱法是将一种（或数
42、种）与溶质离子电荷离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。行为的一种色谱法。关于离子对色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三关于离子对色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种机理：种机理：离子对形成机理；离子对形成机理；离子交换机理；离子交换机理；离子相互作用机理。离子相互作用机理。现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱体系，
43、固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子相反的离子B+，B+离子由于离子由于静电引力与带负电的人组分离子生成离子对化合物静电引力与带负电的人组分离子生成离子对化合物A-B+。离子对生成反应式离子对生成反应式 由于离子对化合物由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离大
44、小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。这就是离子对色谱法分离的基本原理。KABA-水相+A-B+有机相B+有机相 离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性离子对色谱法类型很多，根据流动相和固定相的极性可分为可分为反相离子对反相离子对和和正相离于对正相离于对色谱法。色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固其中以键合相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（定相采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（ODS）等
45、，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇甲醇-水或乙睛水或乙睛-水）。水）。根据离子对生成反应式，平衡常数根据离子对生成反应式，平衡常数 KAB可表示为可表示为水相水相有机相BABAKAB根据上两式，有根据上两式，有 式中式中为相比率为相比率。容量因子。容量因子k随随KAB和和B+水相水相的增大的增大而增大。而增大。键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物
46、的分离问改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛题。此法发展迅速，应用较广泛.1水相BKVVKkABMS 根据定义，溶质的分配系数根据定义，溶质的分配系数 水相水相有机相BKABAKAB 常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；烷基三甲铵作为对离子；常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；size-exclusion chromatography 尺寸排阻色谱法又称尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法凝胶色谱法，主要用于较大分子，主要用于较大分子的分离。
47、与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。析大分子物质相对分子质量的分布。（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。的某些信息。（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度
48、较低的检测器的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于别必须大于10才能得以分离。才能得以分离。尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴。分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定
49、大小的孔穴。体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图。中流出。其渗透过程模型见图。分类：分类：凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的
50、分离。法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography,GPC）：）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。于合成高分子的分子量（分布）的测定。排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。性和刚性凝胶三类。凝胶：指含有大量液体（一般是水）的
