1、课题1微生物的实验室培养课程标准进行微生物的分离和培养。课标解读1.知道培养基的基础知识，进行无菌技术的操作。2.进行微生物培养。1培养基(1)培养基概念按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。培养基的成分及无菌操作技术培养基的成分及无菌操作技术 营养物质营养物质生长繁殖生长繁殖(2)培养基种类包括 培养基和 培养基等。(3)培养基的化学成分一般都含有 、和 四类营养成分。还需要满足微生物生长对 、及 等的要求。固体固体液体液体水水碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐pH特殊营养物质特殊营养物质氧气氧气2无菌技术(1)无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下四个方面对实验操作的 、
2、操作者的 ，进行清洁和 ；将用于微生物培养的器皿、和 等进行；为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行；实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。空间空间衣着和手衣着和手消毒消毒接种用具接种用具培养基培养基灭菌灭菌酒精灯火焰酒精灯火焰周围的物品周围的物品(2)消毒和灭菌消毒：消毒是指使用 方法仅杀死物体表面或内部一部分 的微生物，(包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 消毒法、消毒法、消毒法。灭菌：灭菌是指使用 杀死物体内外 ，(包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 灭菌、灭菌和 灭菌。较为温和的物理或化学较为温和的物理或化学对人体有害对人体有害不包括不包括煮沸煮沸巴氏
3、巴氏化学药剂化学药剂强烈的理化因强烈的理化因素素所有的所有的微生物微生物包括包括灼烧灼烧高压蒸汽高压蒸汽干热干热思维激活1 用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？70%与95%的酒精，哪一种效果更好？为什么？提示酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。1碳源、氮源及生长因子的来源与功能归纳营养要素来源功能碳源无机碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物构成细胞物质和一些代谢产物；有机碳既是碳源又是能源有机碳源糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等氮源无机氮源无机氮：NH
4、3、铵盐、硝酸盐、N2等将无机氮合成含氨的代谢产物有机氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶和核酸的组成成分；参与代谢过程中的酶促反应2.培养基类型划分划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特
5、定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈现黑色，并带有金属光泽)3.无菌技术(1)消毒和灭菌的区别条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌(2)无菌技术主要操作要求实验前应对操
6、作空间、操作人员消毒，对所用器具和培养基灭菌。实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。特别提示(1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物既是碳源，又是氮源、能源。(3)大凡对生长因子不能合成或合成能力有限的微生物，其培养基中均需额外添加生长因子，而许多微生物能自行合成生长因子，其培养基中不需再添加。【巩固1】下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是()。原料蛋白胨/g10101010乳糖/g5555蔗糖/g5555KH2PO4/g2222伊红/g0.4美蓝/g0.06
7、5琼脂/g1020NaCl/g20蒸馏水/mL1 0001 0001 0001 000A.B C D解析高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。答案D1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：称量 倒平板。(2)倒平板的过程：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手 。右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过 。左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，左手立刻 。待平板冷却凝固后
8、，将平板 放置，使皿盖在下、皿底在上。培养基的制备与大肠杆菌的纯化技术培养基的制备与大肠杆菌的纯化技术 计算计算溶化溶化灭菌灭菌拔出棉塞拔出棉塞火焰火焰盖上皿盖盖上皿盖倒过来倒过来2纯化大肠杆菌(1)微生物接种的最常用方法是 和 。(2)平板划线法：通过 在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种 。(3)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别 ，进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得 。平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法接种环接种环连续连续划线划线逐步稀释分散到培养基的表面逐步稀释分散到培养基的表面梯度稀释梯度稀释涂布到琼脂固体培养基的表面涂布到琼脂固
9、体培养基的表面单个细菌形成的菌落单个细菌形成的菌落3菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用 法；对于需要长期保存的菌种，可以采用 法。临时保藏临时保藏甘油管藏甘油管藏思维激活2 除平板划线法与稀释涂布平板法外，还有哪些接种方法？微生物接种技术中最核心的内容是什么？提示微生物接种方法还有斜面接种及穿刺接种等方法，所有微生物接种方法中最核心的内容是“防止杂菌污染，保证培养物的纯度”。1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例，计算配制100 mL的培养基时，各种成分的用量 称量：牛肉膏比较黏稠，可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮
10、，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖 2微生物分离与纯化技术(1)原理微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。(2)方法步骤微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤梯度稀释操作(如图1)图1微生物分离操作流程图a将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。b用移液管吸取1 mL已培养的菌悬液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌悬液与水充分混匀。c从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，
11、注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。以此类推，直到完成最后一支试管的稀释。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处。划线或涂布平板划线分离法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。图2划线示意图涂布分离法：取3个平板，底面分别用记号笔写上104、105和106三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510 min
12、，使菌悬液吸附进培养基(图3)。培养将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中37 培养1624 h，即可长出单菌落(图4)图3涂布法示意图图4斜面接种法(3)结果分析确认培养基制备是否合格为确认培养基制备是否合格，需设置对照实验，即接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 恒温箱中，培养12 h和24 h，观察现象并记录如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则实验失败需要重新制备。接种操作成功的标准如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合该菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中无菌
13、操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次制备。特别提醒(1)进行划线时最后一区和第一区不可接触。(2)平板划线各次灼烧接种环的目的。平板划线操作第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的不同。(3)灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每 次划线的菌种来自上次划线末端划线结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者【巩固2】下列有关平板划线操作的叙述不正确的是()。A第一步灼烧接种环是为了避免接种环
14、上可能存在的微生物污染培养物B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种C在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者解析平板划线操作中，接种环取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种。划线结束仍需灼烧接种环，是为了能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。答案C【例1】氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境
15、。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表1。微生物的营养与培养基类型微生物的营养与培养基类型 图图1表1培养基的组成(1)配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1%的_。(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_。(3)从用途上来说，号培养基和号培养基分别属于_培养基和_培养基。在号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是_。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知，SP1菌在_培养条件下最早停止生长
16、，其原因是_。图2思维导图：深度剖析本题考查培养基的配制原则以及微生物的实验室培养过程，意在考查考生的图表信息转换与分析能力。(1)固体培养基中需加入琼脂作为凝固剂。(2)先配制培养基后灭菌，调pH属于培养基的配制过程，故先调pH后灭菌。(3)从用途上看，号培养基为通用培养基(基本培养基)；号培养基是选择培养基，以氯苯为唯一的碳源，其中为SP1菌提供氮源的成分是硝酸铵。(4)芽孢是在细胞质内高度浓缩脱水形成的抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。(5)由图示可知SP1菌在20 mg/L氯苯培养条件下最早停止生长，20 mg/L氯苯可提供的碳源较少，碳源最早耗尽，影响菌体的生长繁殖。答案(1)琼脂(
17、2)先调pH，后灭菌(3)通用选择硝酸铵(4)芽孢(5)20 mg/L氯苯碳源最早耗尽误区警示(1)琼脂是最常用的凝固剂，但固体培养基未必均加琼脂，如棉子壳培养基也属固体培养基。(2)牛肉膏、蛋白胨等天然物质既可提供碳源，也可提供氮源及生长因子。【例2】培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是()。化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线灭菌高压蒸汽灭菌巴氏消毒法A BC D无菌操作技术无菌操作技术 思维导图：思维导图：深度剖析培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒
18、精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。答案A思维深化几种常用灭菌方法比较(见下表)方法灭菌操作适用对象灼烧灭菌在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧对接种环、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌干热灭菌在干热灭菌箱内，160170 条件下，加热12 h耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等高压蒸汽灭菌在高压蒸汽灭菌锅内，121，100 kPa，灭菌1530 min培养基、发酵设备等紫外线灭菌30 W照射30 min小型接种室、接种箱等【例3】如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是()。A操作前要将接种环放在火焰边
19、灼烧灭菌B划线操作须在火焰上进行C在5区域中才可以得到所需菌落D在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌微生物纯化培养微生物纯化培养 深度剖析本题考查平板划线的操作方法。在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰边进行。在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。答案D归纳提升(1)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。(2)平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(3)两种纯化方法的比较
20、项目优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌旁栏思考题1无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？解析许多微生物对人类是有害的，因此实验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答案无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。2请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿。(2)玻璃试管、烧瓶和吸管。(3)实验操作者的双手。解析消毒和灭菌是无菌技术的两
21、项基本技术，实践中需要根据无菌操作的对象合理地选择使用。原则是既要考虑使用的效果，又要考虑无菌操作对象的承受能力。答案(1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。倒平板操作讨论题1培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答案可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答案通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答案平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖
22、上的水珠落入培养基，造成污染。4在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答案空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。平板划线操作讨论题1为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答案操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单
23、个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答案以免接种环温度太高，杀死菌种。3在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答案划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布平板操作讨论题涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答案应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
