1、酶的发酵生产根据细胞培养方式的不同，酶的发酵生产根据细胞培养方式的不同，可分为可分为固体培养发酵固体培养发酵、液体深层发酵液体深层发酵、(应用最为广泛）应用最为广泛）固定化细胞或固定化原生质体发酵固定化细胞或固定化原生质体发酵概论与流程概论与流程：微生物酶发酵生产的分微生物酶发酵生产的分类类第三节第三节 发酵工艺条件及控发酵工艺条件及控制制 微生物发酵产酶方法微生物发酵产酶方法 1.1.固体培养固体培养:特别适合于霉菌培养特别适合于霉菌培养 2.2.液体培养液体培养:目前酶发酵生产的主要方式目前酶发酵生产的主要方式 3.3.固定化细胞固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器需要特殊的固定化细胞
2、反应器 分解代谢物阻遏 又称称“葡萄糖效应葡萄糖效应”，指葡萄糖和其它容易利用的碳，指葡萄糖和其它容易利用的碳源，其分解代谢产物能阻遏某些酶（尤其是参与分解源，其分解代谢产物能阻遏某些酶（尤其是参与分解代谢的酶）合成的现象。分解代谢物阻遏产生的原因，代谢的酶）合成的现象。分解代谢物阻遏产生的原因，一是葡萄糖等碳源分解氧化积累一是葡萄糖等碳源分解氧化积累ATP，需消耗，需消耗AMP，AMP浓度下降后胞内浓度下降后胞内cAMP会水解生成会水解生成AMP来补充。来补充。cAMP浓度降低使浓度降低使cAMP-CAP复合物减少，酶基因启复合物减少，酶基因启动子上就没足够动子上就没足够cAMP-CAP复合
3、物结合，复合物结合，RNA聚合聚合酶也就无法结合到启动子上，导致转录无法进行，酶酶也就无法结合到启动子上，导致转录无法进行，酶合成受到阻遏。合成受到阻遏。随着细胞生长使随着细胞生长使ATP消耗，消耗，AMP和和cAMP浓度增加，浓度增加，cAMP-CAP结合到启动子上使结合到启动子上使RNA聚合酶也能结合聚合酶也能结合上，酶合成阻遏解除。可见分解代谢物阻遏及其解除上，酶合成阻遏解除。可见分解代谢物阻遏及其解除的实质，是的实质，是cAMP通过启动子对酶基因表达进行调控。通过启动子对酶基因表达进行调控。二、产酶动力学二、产酶动力学 （一）（一）酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生
4、长之间的关系，可将酶根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为的生物合成分为3 3种类型，种类型，4 4种模式，即：种模式，即：同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型1.1.生长偶联型（又称同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成当去除诱导物、细胞
5、进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的立即停止，表明这类酶所对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。a 酶细 胞细胞 或酶浓 度时间2.2.生长偶联型中特殊形式生长偶联型中特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受酶的合成受分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏或或产物的反馈阻产物的反馈阻遏遏。所所对应的对应的mRNAmRNA是不稳定的是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5 细 胞浓度 酶 浓
6、度细胞 浓 度 (OD500)酶浓 度(U/mL)时间 (h)枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 3.3.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所所对应的对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。b酶细胞 细胞 或酶浓 度时 间040801200204060 细 胞浓度 酶浓度酶浓度(单位/ml)
7、时 间(h)0.012.525.037.550.0细 胞浓度(g/L)黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线4.4.非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。c酶细胞细胞 或酶浓 度时 间02040608001020304050 酶浓 度 细胞 浓 度细胞 浓 度 (g/
8、L)时 间 (h)01020304050酶浓 度 (U)黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，
9、使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。动物细胞培养动物细胞培养 从动物机体中取出相关的组织，将它分散从动物机体中取出相关的组织，将它分散成成单单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞让这些细胞生长和繁殖生长和繁殖。.应用.二、动物细胞培养的特点二、动物细胞培养的特点（1）主要用于功能蛋白质和多肽的生产）主要用于功能蛋白质和多肽的生产（2）生长较慢，）生长较慢，15-100h（3）需要添）需要添加抗生素以防
10、染菌加抗生素以防染菌（4）无细胞壁，体积较大，）无细胞壁，体积较大，对剪切力敏感对剪切力敏感，要求严格控制，要求严格控制培养条件如通风、搅拌、培养条件如通风、搅拌、pH、渗透压等渗透压等（5）大部分动物细胞有）大部分动物细胞有锚地依赖性，需要贴壁培养锚地依赖性，需要贴壁培养（6）培养基成分复杂，）培养基成分复杂，分离纯化复杂，成本较高分离纯化复杂，成本较高，多用于，多用于高价值药物的生产高价值药物的生产（7）原代细胞）原代细胞培养培养50代之后即会退化死亡代之后即会退化死亡，需要重新分离，需要重新分离细胞细胞三、动物细胞培养方式动物细胞培养方式悬浮培养悬浮培养 血液、淋巴组织的细胞血液、淋巴组
11、织的细胞贴壁培养贴壁培养 成纤维细胞型（成纤维细胞型（fibroblast）上皮细胞型上皮细胞型(epithilium cell type)游走细胞型游走细胞型(wondering cell type)多形性细胞型多形性细胞型(polymorphic cell type)固定化细胞培养固定化细胞培养进行生产的动物细胞培养方式进行生产的动物细胞培养方式 悬浮培养悬浮培养 瘤细胞、淋巴细胞瘤细胞、淋巴细胞 贴壁培养贴壁培养 滚瓶培养、玻璃瓶、滚瓶培养、玻璃瓶、塑料瓶塑料瓶 微载体培养微载体培养 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 固定化细胞培养固定化细胞培养.植物组织培养的条件.概念贴壁培养 贴壁培养的优点：容
12、易更换培养贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。滤系统。当细胞贴壁于生长基质当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的种产品。同一设备可采用不同的培养液培养液/细胞的比例。适用于所有细胞的比例。适用于所有类型细胞。类型细胞。3.贴壁培养的缺点：与悬浮培养贴壁培
13、养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；细胞的生长；（二）细胞破碎的方法二）细胞破碎的方法l 机械法 l 物理法物理法l 化学法化学法 l 生物法（酶解）生物法（酶解）1.1.机械法：机械法：l 1 1）液体剪切：搅拌、匀浆。）液体剪切：搅拌、匀浆。l 2 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。l2.2.物理法：物理法：l 1 1）超声波破碎法。）超声波破碎法。l 2 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）l 平衡后迅速转入低渗溶液或
14、水中。平衡后迅速转入低渗溶液或水中。l 3 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。l3.化学法化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。使细胞膜结构改变或破坏。l 1 1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用l丙酮、丁醇、氯仿等。丙酮、丁醇、氯仿等。l 2 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面）表面活性剂处理：常用非离子型表面l活性剂，如活性剂，如Triton X-100Triton X-100，TweenTween等。等。l4.4.酶解法（酶解法（e enzymatic lysi
15、snzymatic lysis）：l 外加酶法：外加酶法：l 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。l 自溶法（自溶法（a autolysisutolysis）:l 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 l生溶解的现象。生溶解的现象。微生微生物物 革兰氏阳革兰氏阳性细菌性细菌 革兰氏阴革兰氏阴性细菌性细菌 放线放线菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 同同G+100 300 100 250 层次层次 单层单层 多层多层 多层多层 多层多层 主要主要组成组成 肽聚糖肽聚糖(40%9
16、0%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1%2%)肽聚糖肽聚糖(5%10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30%40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)几丁质几丁质(1%2%)蛋白质蛋白质(6%8%)脂类脂类(8.5%13.5%)多聚糖多聚糖(80%90%)脂类脂类蛋白质蛋白质 各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 各类微生物细胞用什么酶 革兰氏阳性细菌：溶菌酶作用于肽多糖糖苷键革兰氏阳性细菌：溶菌酶作用于肽多糖糖苷键 革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌：溶菌酶加：溶菌酶加EDTA 酵母菌酵母菌：葡聚糖酶作用于葡聚糖：葡聚糖酶作用于葡聚糖 霉菌：
17、几丁质酶霉菌：几丁质酶 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶胶酶 对于阴性菌，除了肽聚糖以外，因为存对于阴性菌，除了肽聚糖以外，因为存在脂多糖，必须加入在脂多糖，必须加入EDTA，这样可以螯，这样可以螯合连接相邻脂多糖的合连接相邻脂多糖的Ca、Mg离子，从而离子，从而破坏脂多糖破坏脂多糖（三）细胞破碎确认（三）细胞破碎确认 1.1.直接测定破碎前后的细胞数：直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.2.测定导
18、电率：测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。估算破碎率。一、提取方法：一、提取方法：（一）盐溶液提取（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用常用稀盐（常用NaClNaCl）溶液（盐溶），）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。，最常用。（二）酸、碱溶液提取（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取第三节第三节 沉淀分离沉淀分离根据溶解度的不同根据溶解度的
19、不同使溶液中的溶质由液相转变为固相析出使溶液中的溶质由液相转变为固相析出实用、简单的初步分离方法，适合于初实用、简单的初步分离方法，适合于初步提纯使用，不适合酶的精制步提纯使用，不适合酶的精制l生物大分子制备中最常用几种沉淀方法：生物大分子制备中最常用几种沉淀方法：l 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）l 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀l 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性）l 等电点沉淀等电点沉淀l 有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1.基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性
20、盐，可向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：产生两种现象：1)盐溶盐溶（salting insalting in）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。2)盐析盐析（salting outsalting out）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。（三）（三）超临界流体萃取超临界流体萃取 与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。萃取剂。超临界流体超临界流体:温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(supercritical fluid，简称SCF)。处于一种既不同于气
21、态，也不同于液态的新的流体态超临界态.它是由于液体与气体分界消失，是即使提高它是由于液体与气体分界消失，是即使提高压力也不液化的压力也不液化的 非凝聚性气体。非凝聚性气体。lSCF性质性质介于液体和气体之间介于液体和气体之间：l1)SCF密度接近于液体，溶解度高。密度接近于液体，溶解度高。l2)SCF粘度和扩散系数接近于气体，粘度和扩散系数接近于气体，l 传质扩散快传质扩散快。基本过程：基本过程：1）在）在SCF中，溶解度大的物质溶中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。质分开。2）降低压力，使）降低压力，使SCF变为气态变为气态（密度降低），溶
22、解物质能力下降，（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。萃取物与溶剂分离。l常用超临界液态常用超临界液态CO2作为萃取剂，作为萃取剂，l 因为：因为：l1）液体）液体CO2无毒无毒l2）临界温度（）临界温度（304.06K）接近常温）接近常温l3）临界压力（）临界压力（7.38MPa）较低）较低l4）操作安全）操作安全(六六)高效（压）液相层析高效（压）液相层析（HPLCHPLC：High PerformanceHigh Performance（pressurepressure）Liquid Chromatography Liquid Chromatography）特点：特点：使用的
23、固相支持剂颗粒很细，表面积很大使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。因而分辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。固定相（柱填料）：固定相（柱填料）：常用常用坚硬、耐高压坚硬、耐高压，粒度小粒度小的硅胶。的硅胶。流速为240ml/hr颗粒大小为5080目。洗脱体积（洗脱体积（ml）1.基本原理基本原理 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。数次的交换和分配而达到分离的过程。许多类型的柱层析都可用许多类型
24、的柱层析都可用HPLCHPLC来代替，来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。2.分类分类 按溶质（样品）在两相分离过程的物理按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类：化学性质分类：亲和色谱：亲和色谱：亲和力亲和力 吸附色谱：吸附色谱：吸附力吸附力 离子交换色谱：离子交换色谱：离子交换能力离子交换能力 凝胶色谱凝胶色谱：分子大小而引起的体积排阻分子大小而引起的体积排阻 分配色谱：分配色谱：分配系数分配系数金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法使酶的催化特
25、性发生改变的修饰方法 通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制作用，阐明催化机制 适用对象：适用对象：（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为作为 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用持酶的活性和构象起稳定作用金属酶纯化时仍保留着金属酶纯化时仍保留着的功能金属离子的功能金属离子金属离子置换修饰 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 常见的金属酶及其离子种类常见的金属酶及其离子种类-淀粉酶淀粉酶 Ca2+、M
26、g2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 Zn2+过氧化氢酶过氧化氢酶 Fe2+酰基氨基酸酶酰基氨基酸酶 Zn2+超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+细胞色素细胞色素 P450 单加氧酶单加氧酶 Fe2+固氮酶固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV)主要的金属离子主要的金属离子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等等Cyt P450 1.酶的提纯酶的提纯 2.除去原有金属离子除去原有金属离子加入加入，如，如 EDTA 等，让酶分等，让酶分子中的金属离子与子中的金属离子与 EDTA形成螯合物形成螯合物透析、超滤或层析除去螯合物透析、
27、超滤或层析除去螯合物 3.加入置换的离子加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子用透析或层析等方法除去未结合的离子一、金属离子置换修饰的方法一、金属离子置换修饰的方法二、金属离子置换修饰的作用 1.阐明金属离子对酶催化作用的影响阐明金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅辅基可逆结合，从而起到催化作用基可逆结合，从而起到催化作用 2.提高酶的催化效率提高酶的催化效率将将 Zn 型型-淀粉酶置换成淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高型，活力可
28、提高 20%30%3.增强酶的稳定性增强酶的稳定性Fe-SOD 置换成置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低敏感性降低 4.改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位的酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被被 Co 置换后置换后，酶的底物专一性（，酶的底物专一性（Km 值）和最适值）和最适 pH 都显著改都显著改变变第三节 侧链基团修饰 采用一定的（化学）方法，使酶蛋白采用一定的（化学）方法，使酶蛋白，从而改变酶催化特性的修饰方法，从而改变酶催化特性的修饰方法 用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、用于研究各种基团在酶分子中的作用
29、及其对酶的结构、特性和功能的影响特性和功能的影响荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成成对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力对特殊底物的束缚能力利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量改变酶的结构和催化性能改变酶的结构和催化性能 蛋白类酶蛋白类酶侧链基团可组成各种次级键，对侧链基团可组成各种次级键，对蛋白质空间结构的形成蛋白质空间结构的形成和和稳定起重要
30、作用，当这些功能基团发生改变，引起稳定起重要作用，当这些功能基团发生改变，引起，使结构发生变化，引起酶特性和功能的改变，使结构发生变化，引起酶特性和功能的改变侧链基团：侧链基团：亲核性取代的氨基酸残基亲核性取代的氨基酸残基:Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His 等等亲电性亲电性侧链基团：芳香环、吲哚环侧链基团：芳香环、吲哚环亲电性取代的氨基酸残基亲电性取代的氨基酸残基:Tyr、Trp 核酸类酶核酸类酶磷酸基，核糖糖环上的磷酸基，核糖糖环上的OH、碱基杂环及其、碱基杂环及其NH2、OH等等侧链基团修饰几种重要的修饰反应 烷基化烷基化多种基团均可发生，包括芳环和杂环多种基团均可发生，包括
31、芳环和杂环 氧化和还原氧化和还原酚基、酚基、SH、杂环等、杂环等 芳香环取代芳香环取代涉及涉及 Phe、Tyr、Trp 等几种芳香族氨基等几种芳香族氨基酸酸 其他反应，如其他反应，如 CNBr 裂解反应裂解反应各类侧链基团的修饰 胍基修饰（胍基修饰（Arg）羟基修饰（羟基修饰（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修饰（咪唑基修饰（His）吲哚基修饰（吲哚基修饰（Trp）甲硫基修饰（甲硫基修饰（Met）分子内交联分子内交联修饰 氨基在酶蛋白中主要是氨基在酶蛋白中主要是 和肽链末和肽链末端氨基端氨基的的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选择亲核反应活性很高，易被选择性修饰性修饰 一般情况下一般情况下 -
32、NH2 的的 pKa=10，其解离程度取，其解离程度取决于微环境决于微环境 氨基的修饰反应主要有酯化、氨基的修饰反应主要有酯化、N-烷基化等烷基化等修饰反应 修饰反应 修饰 羧基在酶蛋白中主要是羧基在酶蛋白中主要是，以及肽链的末端羧基，以及肽链的末端羧基 在水溶液中，在水溶液中，COOH 通常解离成通常解离成，亲核，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应、成酰胺反应 修饰反应修饰反应 羧基的修饰反应 酯化反应修饰修饰 巯基在酶蛋白中的来源是巯基在酶蛋白中的来源是 巯基巯基，往往是酶分子中反应活性最高的基，往往是酶分子中反应活性最高的
33、基团团 巯基容易被氧化成巯基容易被氧化成，在维持蛋白亚基之，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物物修饰反应修饰反应修饰反应修饰反应 修饰反应修饰反应 胍基（N=C(NH2)2）修饰 胍基存在于酶蛋白的胍基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上 在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用用 胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条
34、件下有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应反应，一般是可逆反应五、酚基和羟基（五、酚基和羟基（OH）修饰）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr 羟基的羟基的，通常修饰剂能同时修饰，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基羟基、氨基和巯基相比于相比于 Ser 和和 Thr 的羟基要活泼一些的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应取代反应六、咪唑基修饰 咪唑基存在于酶蛋白的咪唑基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上 对对 His 咪唑基的修饰，一般是通过咪唑基的
35、修饰，一般是通过 N-烷基化或烷基化或 C-亲核取代来进行亲核取代来进行 对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响七、吲哚基修饰 吲哚基存在于酶蛋白的吲哚基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上 Trp 残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难很多应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应应 有时候有时候 Tyr 会对吲哚基的修饰产生干扰会对吲哚基的修饰产生干扰 采用双功能基团化合物（双功能
36、试剂），在酶分采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对子中对的两个氨基酸残基侧链基团的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联之间进行共价交联 双功能试剂有两个可以连接反应的基团双功能试剂有两个可以连接反应的基团固定化酶的概念 固定化酶是指固定化酶是指固定固定在一定不溶性在一定不溶性载体载体上并上并在一定的空间范围内进行催化反应的在一定的空间范围内进行催化反应的酶酶。水不溶性载体水不溶性载体水溶性酶水溶性酶固定化技术固定化技术 水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）固定化酶）第二节 固定化酶的方法 固定方法分为固定方法分为需要载需要载体体和和不需要载体不需要载体两类。两类。需要需要载体载体的方
37、法有的方法有 1.物理吸附法物理吸附法 2.离子键结合法离子键结合法 3.共价结合法共价结合法621.1.酶的稳定性明显改善；酶的稳定性明显改善；2.2.酶的利用效率高；酶的利用效率高；3.3.易于分离纯化；易于分离纯化；4.4.反应条件易于控制；反应条件易于控制；5.5.适合于多酶催化反应适合于多酶催化反应。63 固定化方法固定化方法 分类分类非共价结合法非共价结合法物理吸附法物理吸附法离子结合法离子结合法化学结合法化学结合法共价结合法共价结合法交联法交联法包埋法包埋法微囊法、网格法微囊法、网格法一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法641、吸附法、吸附法通过通过氢键、疏水作用氢键、疏水作用和
38、和电子亲和力电子亲和力等物理等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶固定化酶。固体吸附剂固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等孔玻璃等;(1)(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用活，载体廉价易得，可反复使用;(2)(2)物理物理吸附结合能力弱吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢，酶与载体结合不牢固固易脱落易脱落.back65吸附法吸附法662、包埋法、包埋法 包埋法是将包埋法是将聚合物的单体聚合物的单体与酶溶液混合，与酶溶液混合，再借助于聚合
39、再借助于聚合催化剂催化剂(包括交联剂包括交联剂)的作的作用进行用进行聚合聚合，酶被，酶被包埋包埋在聚合物中以达在聚合物中以达到固定化到固定化。多孔载体多孔载体琼脂、聚酰胺琼脂、聚酰胺、海藻酸钠、角、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶等叉菜胶、明胶等(1)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法(2)(2)半透膜包埋法半透膜包埋法67凝胶包埋和半透膜包埋凝胶包埋和半透膜包埋68(1)凝胶包埋法凝胶包埋法l 天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，影响小，强度较差强度较差l 合成凝胶强度高，耐温度、合成凝胶强度高，耐温度、pHpH值变化强，值变化强，因需聚合反应而使因需聚合反应而使部分
40、酶变性失活部分酶变性失活l 适用性：不适用于适用性：不适用于底物或产物分子很大底物或产物分子很大的酶类的固定化的酶类的固定化69如如:天然高分子衍生物凝胶天然高分子衍生物凝胶:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合凝胶：合成聚合凝胶：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好机械性能好，但有疏水结构，但有疏水结构 尼龙尼龙 亲和性差亲和性差 酶活力易受损酶活力易受损70凝胶凝胶包埋条包埋条件件酶活性酶活性强度强度天然凝天然凝胶胶琼脂、海藻酸琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、钙、角叉菜胶、明胶明胶温和温和不变不变差差合成凝合成凝胶胶聚
41、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、光交联树脂光交联树脂聚合反聚合反应应部分失部分失活活高高两类凝胶的特点比较两类凝胶的特点比较71 1.制备凝胶制备凝胶 一般的制备过程如下：将溶于缓冲液的酶溶液加入含一般的制备过程如下：将溶于缓冲液的酶溶液加入含有有丙烯酰胺丙烯酰胺(单体单体)和甲叉双丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(交联剂交联剂)的溶液中，的溶液中，再加再加 加速剂和催化剂，混合，于加速剂和催化剂，混合，于25保温保温10min，便，便含酶凝胶含酶凝胶聚合聚合。2.分散凝胶获得凝胶颗粒分散凝胶获得凝胶颗粒 将凝胶于低温储存或冷冻干燥。为制得将凝胶于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化珠状固定化酶酶，可以在聚合反
42、应开始时，立即转入到疏水相，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种一种乳化剂，与水相有相同密度乳化剂，与水相有相同密度)的的有机溶液有机溶液中，使中，使分散分散成成含酶的珠状凝胶颗粒含酶的珠状凝胶颗粒。72二、海藻酸钙包埋法装置二、海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，把酶或细胞分散在其中，液，把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用然后将其滴入凝固浴中（常用CaClCaCl2 2溶液），使海藻酸钠中的溶液），使海藻酸钠中的NaNa+部分被部分被CaCa2+2+所取代形成由所取代形成由多多价离子交联价离子交联的离子网络凝胶的离子网络凝胶颗粒大小
43、可实时监控颗粒大小可实时监控73 卡拉胶是由角叉菜卡拉胶是由角叉菜(又名鹿角菜又名鹿角菜)中提取的一中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将酶在酶在37-50溶于水中，将卡拉胶在溶于水中，将卡拉胶在40-60 溶于生理盐水中，二者混合后，趁热滴溶于生理盐水中，二者混合后，趁热滴在在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，分散成适当溶液中硬化，分散成适当大小的颗粒大小的颗粒,即为固定化酶。即为固定化酶。74(2)半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜、聚酰胺膜、火棉膜等，半透膜、聚酰胺膜、火棉膜等，孔径孔径几埃至几埃至几十埃（几十埃（1010-10-10米），米）
44、，比酶分子直径小比酶分子直径小适用于适用于底物和产物都是小分子底物和产物都是小分子的酶的酶75微胶囊型固定化酶微胶囊型固定化酶制制备备酶酶+亲水性单体溶于水亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液疏水性单体溶于有机溶液混合混合乳乳化化剂剂乳化乳化酶液分散成小水滴酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单亲水性、疏水性单体在两相界面上聚体在两相界面上聚合成半透膜，将酶合成半透膜，将酶包埋包埋Tween-20 破乳破乳离心离心半透膜半透膜酶液滴酶液滴763、结合法、结合法选择适宜的载体选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键通过载体的共价键或离子键(非共非共价健价健)与酶结合在一起的固定化方法与酶结合在一起的
45、固定化方法酶酶载载体体(1)离子键结合法离子键结合法载体载体:DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、TEAE-TEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝葡聚糖凝胶等胶等不溶于水的离子交换剂不溶于水的离子交换剂操作操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少活力损失少,结合力较弱，条件结合力较弱，条件(pH(pH值和离子强度值和离子强度)改改变时变时,酶易脱落酶易脱落77(1)离子键结合法离子键结合法78(2)(2)共价键结合法共价键结合法载体分类载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖
46、凝胶等纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等;分三类分三类:天然有机载体天然有机载体(多糖、蛋白质）、多糖、蛋白质）、无机物无机物（玻璃、陶瓷）、（玻璃、陶瓷）、合成聚合物合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）（聚酯、聚胺、尼龙）方法载体活化方法载体活化:借助某种方法，在借助某种方法，在载体载体上上引进引进某一某一能与能与酶分子上某一基团酶分子上某一基团反应的反应的活泼基团活泼基团优点优点:结合很牢固结合很牢固，酶可连续使用较长时间，酶可连续使用较长时间缺点缺点:操作复杂，共价结合可能操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象影响酶的空间构象而影而影响酶的催化活性，共价反应响酶的催化活性，共价反应固定时酶活力有
47、损失固定时酶活力有损失79载体活化方法载体活化方法载体活化的意义载体活化的意义活化方法活化方法1 1、重氮法、重氮法;2 2、叠氮法、叠氮法;3 3、溴化氰法、溴化氰法;4 4、烷基化法、烷基化法.80 重氮法重氮法将含有将含有苯氨基苯氨基的不的不溶性载体与溶性载体与亚硝酸亚硝酸反应生成重氮盐衍反应生成重氮盐衍生物，使载体引进生物，使载体引进了活泼的重氮基团了活泼的重氮基团再与酶分子上酚基再与酶分子上酚基和咪睉基共价偶联和咪睉基共价偶联81 叠氮法叠氮法含有含有酰肼酰肼基团的载体可用基团的载体可用亚硝酸亚硝酸活化，生成叠活化，生成叠氮化合物，再与羟基、巯基偶联氮化合物，再与羟基、巯基偶联82
48、溴化氰法溴化氰法含有含有羟基羟基的载体，如纤维素等，可用的载体，如纤维素等，可用溴化氰溴化氰活活化生成亚氨基碳酸衍生物，再与酶氨基偶联化生成亚氨基碳酸衍生物，再与酶氨基偶联83 烷基化法烷基化法含含羟基羟基的载体可用的载体可用三氯三氯-均三嗪均三嗪等多卤代物等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体进行活化，形成含有卤素基团的活化载体back844、交联法、交联法借助借助双功能试剂双功能试剂使酶分子之间发生使酶分子之间发生交联交联作用，制成作用，制成网状网状结构结构特点：特点：此法与共价结合法一样也是此法与共价结合法一样也是利用利用共价键共价键固定酶的，所不同的是固定酶的，所不同的是不使用
49、载体不使用载体双功能试剂：双功能试剂：戊二醛、己二胺、双戊二醛、己二胺、双偶氮苯偶氮苯等等酶酶双功双功能剂能剂85双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H4、交联法、交联法86 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。87戊二醛戊二醛:优点：优点：结合牢固，可以长时间使用结合牢固，可以长时间使用缺点：缺点：因交联反应激烈，酶分子多
50、因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，个基团被交联，酶活损失大酶活损失大，颗粒，颗粒较小，使用不便较小，使用不便双重固定化将其与吸附法、包埋法双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用联合使用88酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶back895、热处理法、热处理法在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内在菌体体内适用于适用于热稳定性较好的酶的固定化热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间严格控制加热及其时间back
