1、1PCR实验室存在问题及解决措施实验室存在问题及解决措施 上海市临床检验中心上海市临床检验中心 肖艳群肖艳群2回顾1990年：PCR 技术在国内开始用于临床检测90年代中期：假阳性？（假阴性？）关于暂停临床基因扩增检验的通知（卫医政发1998第9号）临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号）医疗技术临床应用管理办法的通知（卫医政200918号）临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）3医疗技术临床应用管理办法 （分类分级管理、审核）第一类第一类：安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其 安全性、有效性的技术医疗机构自行组织实施第二类：安全
2、性、有效性确切，涉及一定伦理问题或者风险较高，卫生行政部 门应当加以控制管理的医疗技术省级卫生行政部门指定或者组建的技术机 构负责技术审核第三类：具有下列情形之一，需要卫生行政部门加以严格控制管理的医疗技术卫生 部或卫生部委托省级卫生行政组织负责对指定的第三类医疗技术进行审核 （一）涉及重大伦理问题 （二）高风险 （三）安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证 （四）需要使用稀缺资源 （五）卫生部规定的其他需要特殊管理的医疗技术4 上海市第二类医疗技术目录首批（首批（1818项）（项）（2009.8.24 2009.8.24）第二批（第二批（6 6项）（项）（2012.1.42012.
3、1.4）冠心病介入诊疗技术体外冲击波碎石/经输尿管镜碎石取石术先天性心脏病介入诊疗技术人工椎间盘置换术心脏导管消融技术经尿道前列腺汽化消融术起搏器介入诊疗技术内科胸腔镜诊疗技术心室辅助装置植入技术急性脑梗死溶栓术扩大全胰腺切除术直肠癌根治术内镜逆行胰胆管造影诊疗技术髋、膝关节置换技术角膜移植技术白内障超声乳化技术准分子激光角膜屈光手术口腔种植诊疗技术输尿管镜技术面部轮廓整形技术血液透析技术临床基因扩增检验技术医用高压氧治疗技术本市首次开展（未纳入卫生部规定的第三类医疗技术目录）的医疗技术5 卫生部公布第三类医疗技术目录 同种器官移植、变性手术、心室辅助装置应用技术、基因芯片诊断技术（2011年
4、5.3日由三类调整为二类）等共19项6沪临检办沪临检办201120112929号号关于印发关于印发上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法和和上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法的通知的通知 附件1：临床基因扩增检验及分子诊断相关技术审核专家库名单 附件2：上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法 附件3：上海市医疗机构基因芯片技术诊断审核办法 附件4:上海市医疗技术临床应用能力技术审核申请书 附件5：上海市临床基因扩增检验及分子诊断相关技术审核流程（首页医疗技术准入专栏中下载）7 基本要求（1 1）医疗机构
5、基本要求）医疗机构基本要求（2 2）人员基本要求）人员基本要求（3 3）临床应用基本规范和管理要求）临床应用基本规范和管理要求（4 4）实验室设置基本要求）实验室设置基本要求 （5 5）人员管理）人员管理 （6 6）设备管理）设备管理（7 7）标本管理）标本管理 （8 8）质量管理）质量管理 （9 9）检测要求等）检测要求等8 医疗机构要求二级及以上医院独立实验室 （公司）实验室应集中设置、统一管理实验室必须通过上海市临床检验中心技术审核合格并报上海市卫生监督所备案后方可开展检测项目，以后每3年必须进行复审实验室通过审核后应根据其核定的技术审核项目开展检测工作。如需要增加检测项目，应向上海市临
6、床检验中心提出扩项申请，并报上海市卫生监督所准入后方可开展检测项目 实验室开展分子诊断新技术，应向上海市临床检验中心提出新技术申请，并报上海市卫生监督所准入后方可开展新技术的检测项目 9 临床应用基本规范和管理要求 以科研为目的的临床基因扩增检验项目，不得向临床出具检验报告，不得向病人收取任何费用 10 检测要求项目：新开展检测项目应有相应临床科室出具的评估报告仪器：必须三证齐全试剂：必须SFDA批准新开展项目在技术审核前应进行方法学验证仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证 11 分包有外送检验项目的实验室应与委托实验室签订相关协议，有委托实验室资质和质量保证的证明文件实验室有外送检验项目的
7、要求和规定，并做好外送样品的登记和记录，有委托实验室标本运送和交接过程的监控和记录 定期评审委托实验室检测质量，并有相关记录 分包后自行开展，需确认具备开展相关检测的能力12 审核前准备工作实验室按要求设置、装修仪器、人员到位完成质量手册、程序文件、操作规程编写完成方法学验证参加至少一次室间质评，成绩合格检验前、中、后流程畅通13 申请技术审核需递交的材料上海市临床技术临床应用能力技术审核申请书q医疗机构基本情况q申请单位相关学科基本情况项目负责人基本情况学科人员基本情况项目所在地实验室的专用设备、设施及工作基础拟开展检验项目q开展该技术的目的、意义和实施方案q该项医疗技术的基本概况技术路线国
8、内外应用情况与同种疾病的其他检测技术的特点及费用比较质量控制措施14 技术审核需递交的材料医疗机构执业许可证副本复印件技术人员相关资格证书复印件与该技术有关的实验室平面图医疗机构医学伦理审查报告仪器、试剂三证复印件方法学性能验证报告室间质评成绩质量手册、程序文件、操作规程申请在本市首次开展的医疗技术还需递交：国内外有关该技术研究和使用情况的检索报告及技术资料15PCRPCR审核审核流程流程（初审、复审、扩项、新技术）医疗机构提出技术审核申请申请资料审查受理、登记、编号发出技术审核受理通知书文件内容审查 确定审核专家组成员书面通知专家、医疗机构组织专家现场审核汇总专家组审核意见医疗机构就专家意见
9、整改完成技术审核结论报告送达医疗机构补充资料不予受理退回修改启动回避程序1个月内提交整改报告现场确认整改效果报卫生行政部门16审核结果合格基本合格不合格，12个月后重新申请17不合格重新申请时间依据医疗技术临床应用管理办法（卫医政发200918号）第二十三条：有下列情形之一的，医疗机构不得向技术审核机构提出医疗技术临床应用能力技术审核申请 （三）申请的医疗技术距上次同一医疗技术未通过临床应用能力技术审核时间未满12个月的 第二十四条：未通过审核的医疗技术，医疗机构技术不得在12个月内向其他技术审核机构申请同一医疗技术临床应用能力再审核 18一票否决项一票否决项医疗机构临床基因扩增检验实验室管理
10、办法医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 第四章第四章 第二十条第二十条开展的临床基因扩增检验项目超出市卫生行政部门核定范围的 使用未经国家食品药品监督管理局批准的临床试剂开展临床扩增检验的 在临床基因扩增检验中未开展室内质控的在临床基因扩增检验中未参加室间质评的 在临床基因扩增检验中弄虚作假的 以科研为目的的基因扩增检验项目向患者收取费用的 使用未经培训合格的专业技术人员从事临床基因扩增检验工作的 使用非本院技术人员从事临床基因扩增检验工作的严重违反国家实验室生物安全有关规定或不具备实验室生物安全保障条件的现场标本考核成绩（该项目的可接受结果数/该项目的总的测定结果数100）80%的 19
11、实验室设置与设备存在问题整改措施各缓冲间相通未安装冲眼器移动紫外车缺或已坏未及时更换20设施与环境存在问题存在问题整改措施整改措施温、湿度超出实验规定范围，未见纠正措施安装独立空调检测前、后标本放置同一冰箱，未见标识加以区分标本分区放置，并用标识加以区分1、进入和使用实验室各区域未见相应措施加以限制和控制2、科研人员进出管理混乱1、安装门禁或贴标识加以限制和控制2、非检测人员进出登记不同工作区域内物品混用（移液器、手套、记录未按要求分区放置）各区物品贴区域标识加以区分1、清洁用具混用或共用2、未对相关人员培训1、各区专用清洁用具；2、指定人员；3、培训；4、记录杂交在扩增区、杂交膜存放在扩增区
12、；杂交在产物分析区，杂交膜存放在产物分析21操作规程存在问题整改措施1、内容不详细，缺可操作性（方法学验证、耗材试 剂质检、室内质控、分析前措施、设备校准参数 及判断标准等）2、操作规程不是现行有效3、实验室各区未放置相关SOP4、试剂重要参数修改后SOP未及时更新5、内部校准、无EQA的室间比对缺SOP 8、标本运送、保存、处理与SOP规定不一致1、检验项目操作规程应参照临床检验操作规程编写要求（WS/T227-2002和说明书编写2、更换试剂批号时仔细阅读试剂说明书3、SOP为操作指导性文件，应具可操作性4、写、做、记一致22人员 存在问题整改措施1、缺培训计划、或计划缺乏针对性；2、未见
13、培训记录3、有培训记录未见效果评估记录 1、计划制定应有针对性，每年有重点2、培训形式可以多样：讲座（包括小组教学）、计算机相关的练习、自学、观看示例-现场或视频、实践监督、实践结果的自我评估、特殊样品的检验或鉴定3、效果评估形式：口头提问、笔试、现场操作演示、获取合格证、填写培训小结等初审实验室大多数缺员工是否能胜任其岗位的记录1、实验室应制定员工能力评审的内容和方法（新进、转岗）2、定期评审员工的工作能力，并保存胜任的证据：直接观察常规工作过程和程序、直接观察设备维护和功能检查、监控检验结果的记录和报告过程、核查工作记录、评估解决问题的技能、使用特殊材料执行一个给定程序1、实验室技术人员档
14、案内容过于简单：只有学历、职称、PCR上岗证书复印件，其余缺2、未及时更新实验室应分册建立技术人员技术档案，档案至少应包括以下内容：学历、职称、临床基因扩增检验技术上岗证书复印件；培训、能力评审等资料，并定期更新23仪器、试剂和方法存在问题整改措施1、冰箱温度缺允许范围2、冰箱温度非检测日不记录3、冰箱温度计缺或坏，仍在记录1、根据试剂说明书要求规定试剂储存要求，2、每日实施监控并有记录检测、科研仪器无标识加以区分每件设备均应有唯一性标签、标记或其他识别方式，有明显的标识表明仪器的状态仪器设备档案内容不全应保存主要设备的档案，档案内容应包括：设备标识、型号、序号或其它唯一性识别、到货日期和投入
15、运行日期、目前放置地点、接收时的状态、仪器使用说明书或其存放处、证实设备可以使用的设备验证报告、校准和/或检定报告、维护、损坏、故障或维修的记录24存在问题整改措施1、仪器投入使用前未进行校准2、部分仪器未定期校准3、校准未覆盖检测常用量程（移液器、恒温金属浴）4、校准报告不规范，缺原始记录5、校准报告中校准数据错误未发现6、校准不符合要求的设备仍在使用（移液器、高速 冷冻离心机）7、未引用校准出现的校准因子（、温度计、恒温金 属浴）8、内部校准存在问题：用于校准恒温金属浴的温度 计未校准；且最小刻度为1，不适用于金属浴 校准；内部比对（温度计）无记录或记录信息不 全1、校准SOP中制定仪器校
16、 准参数、判断标准2、实验室检测人员提出校 准要求3、实验室审核校准报告4、内部比对记录信息最少应包括：比对设备编号、用于比对设备的校准信息（校准日期、校准有效期、校准单位）、比对时间、标准设备实测数据、比对设备实测数据、判断标准、结论、比对人、比对日期、科室负责人25存在问题整改措施1、未对不同试剂批号进行质检2、未对耗材进行质检定性试剂质检定量试剂质检抑制物质检（除非标明不含抑制物）使用上一次的扩增曲线判断结果每次扩增应都做标准曲线1、更换仪器只做部分项目的验证2、验证参数不全、标本数量不足3、参比方法选择有缺陷，无法比较4、标本类型更换未做验证5、不是实验室独自完成，很难反应实际情况如未
17、对试剂或方法进行重要修改，应对所采用的试剂或方法进行性能验证，实验室应独自完成验证试验定量：精密度、准确度、检测下限、线性范围定性：精密度、符合率26CLSI:相关文件项目名称内容123456789CLSI C24-A2CLSI C28-A2CLSI EP5-ACLSI EP6-ACLSI EP7-ACLSI EP9-A2CLSI EP10-A2CLSI EP13RCLSI GP10-A定量测定统计质量控制：原理和定义如何确定临床检验的参考区间临床化学设备精密性能的评价定量分析方法现行的评价临床化学中的干扰物检测方法用患者标本进行方法比对及偏倚估计定量临床检验方法的初步评价实验室统计量-标准差
18、使用ROC曲线评价临床试验的准确度：批准指南性能验证前的准备应熟悉待验证的检测系统应熟悉验证方案的步骤(PCR检测项目成本高、阳性标本来源困难,精密度和正确度验证建议采用EP15-A2 文件)制定质量保证措施确保足够的样本数量和覆盖较宽检测范围确定比较方法27精密度验证（精密度验证（EP5-A2EP5-A2）重复性:指在相同条件(时间、校准、操作者、仪器)下获得的精密度,也称批内精密度实验室内精密度:同一实验室内，使用相同的设备,由不同的操作者在不同时间内获得的精密度,也称总精密度.(不包括大的设备维护、仪器校准和更换试剂批号等)28实验要求试剂:同一批号实验样本:以前分析过的病人样本 其他已
19、知值的物质浓度要求:医学决定水平 厂家说明书精密度指标所用浓度内容:重复性 实验室内精密度29实验步骤5天,每日一分析批,每日2个浓度水平,每一水平上同一样本4次重复测定.每天做室内质控,如果失控,剔除数据,重新进行测定按照厂家说明书规定进行校准计算结果判断：与厂家申明比较30正确度验证（正确度验证（EP9-A2EP9-A2）比对方法:利用临床病人样本,比较两个测量程序间的结果参考物质31比对方法检测20份患者样本,其浓度水平覆盖方法的可报告范围在实验室以常规操作方式检测新鲜患者标本在3-4天时间内,每天由实验和可比较方法测定5-7份样本每天做室内质控,如果失控,剔除,重新测定检查比较数据识别
20、任何差异的结果 出现单个样本异常(两个测量方法之间结果偏差很大)时:用两个测量方法对样本进行重复测定,以区分:特异性导致的误差 其他偶然或仪器的系统误差 弃去偏差异常大样本,重新测定另一样本32计算：偏移、相关系数结果判断：与厂家（实验室）申明比较33使用参考物质的正确度方案参考物质 有证参考物质 能力验证计划中具有指定值的参考物质 厂家具有指定值的物质 EQA计划中的物质 由几家实验室分析具有指定值来自第三方的物质 制备的已知浓度的标准物质34实验步骤至少2个物质,浓度为可报告范围中高和低的决定性浓度在3-5天内每天测定一次,每次重复2次计算每个浓度测定结果的均值和标准差,以及置信区间帮助指
21、定值的验证35结果判断如果验证区间包括定值数字,验证通过 验证区间包括定值,但偏倚较大,可增加2-5个样本进行检测,用所有数据进行统计以增加统计效能如果验证区间未能包括定值数字,验证不通过 计算偏倚和允许总误差是否符合临床需要或者实验室要求 联系厂家协助36定量检出限的验证(EP-17A)概念l能可靠检出分析物的最低实际浓度,并在该浓度下的总误差符合准确度要求l总误差目标来源:实验室的需求、室间质评结果、厂家的申明37实验样本低浓度参考物质已知浓度的样品适当稀释成3-5个低浓度实验样品38实验步骤至少25个重复测量每个样品重复测量的结果与该样品的参考值比较,以确定是否超出目标误差,超过误差目标
22、的结果数量可用于评价此方法在该浓度是否合适39 20-1000个检测值符合超出LoB预期95%比例的下限 检测数 观察比例的下限(%)检测数 观察比例的下限(%）20 8530 8740 8850 8860 8870 8980 8990 90100 90 150 91200 92250 92300 92400 93500 931000 9440分析测量范围（EP6-A）分析测量范围(线性范围):指患者样本未经任何处理(稀释、浓缩或其他预处理),由检测系统直接测量得到的可靠结果范围,在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度(真值)呈线性比例关系.临床可报告范围:指定量检测项目向临床能报
23、告的检测范围,患者样本可经稀释、浓缩或其他预处理.线性:检测样本时,在一定范围内可以直接按比例关系得出分析物含量的能力.41实验样品准备选择与临床样本同样的基质,不含干扰物质;或厂家推荐的产品数量 验证实验:5-7个不同浓度的样本,高值样本应高于线性上限30%,低值样本低于线性下限42实验方法实验方法：上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,按试剂说明书操作,将每一浓度样本重复检测2次,计算线性相关系数结果判断：线性范围应符合制造商规定的要求,且线性相关系数|r|0.9743定性检测项目的性能验证诊断明确的定性检测性能评估:灵敏度、特异性诊断不明确的定性检测性能评估:结果的一致性,Kapp
24、a值表示44诊断明确的定性检测比较方法:目前正在使用的、”金标准”方法、某种定量方法或临床诊断样本要求:量足够大,稳定样本数量:取决于评价者的目的结果不一样标本的处理:用金标准或参考方法明确结果45检测方法与明确诊断比较2*2列联表检测方法明确诊断阳性阴性总数阳性阴性ABA+总数46诊断不明确的定性检测项目性能评估 检测方法、可比较方法一致程度比较检测方法可比较方法阳性阴性总计阳性阴性总计 n47个体化检测系统性能验证的特殊性n验证性能参数：精密度/重复性、正确度（突变型的检测能力）、分析特异性（如正常野生型基因组与突变型之间的区分能力）、检出限（每个反应能检出的最小突变拷贝数）、选择性（突变
25、型与野生型不同比例设定）n覆盖标本的范围（如不同的基因型）n标本的类型（血液、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织）n性能验证存在难点：患病率低或罕见病其阳性标本少 缺乏金标准4849标本管理存在问题整改措施HCVRNA检测项目未按操作规程要求及时送达 实验室应监控标本运送到实验室的过程，标本运送应符合时间、温度、生物安全的要求接收标本时标本状态信息记录不完善应记录收到标本的日期和时间，同时应记录标本接收时的详细状态分泌物标本、分子病理标本是否符合要求，缺记录实验室应确定标本是否符合检测要求,拒收标本原因要明确实验室对标本拒收原因缺定期分析及整改措施定期评估，制定切实可行的整改措施，提高工作效率
26、1、标本保存时间短于规定时间；2、标本保存时间与温度无法确保其性状稳定 标本应按相关规定保存（应结合检测报告复核的提示时间50质量控制存在问题整改措施对暂无室间质评的项目缺验证其结果可靠性的措施或规定实验室应制定质量控制文件，编写对暂无室间质评的项目验证其结果可靠性的措施或规定的SOP初审实验室方法学验证时有时不做室内质控理解室内质控的作用室内质控未监控核酸提取、扩增整个过程应监控核酸提取、扩增、产物分析等标本检测全过程 扩增条件相同的不同检测项目只做其中一个项目室内质控应分别做室内质控内标未出现，阴性结果仍发出内标应符合要求51存在问题整改措施扩增漏做室内质控 每次扩增都应做室内质控实验室未
27、根据统计学质控方法建立实验室自身检测项目的控制限 定量项目：实验室应根据统计学质控方法建立检测项目的控制限定性项目：根据试剂说明书要求判断失控未见原因分析，或分析滞后，或原因分析缺乏针对性失控及时查找原因，采取纠正措施，填写失控分析报告失控时大多数实验室只重做室内质控，未评估对检测结果的影响如遇失控，应对已测标本进行抽样检测进行质量偏差评估室间质评样品特殊对待，无法反应实际情况应与临床标本同等对待室间质评结果原因分析流于形式，缺乏针对性 分析室间质评反馈结果，对不合格项目，应及时查找原因，采取纠正措施52室间比对实验室无相关资质；比对标本浓度选择单一无EQA项目应定期（每年至少2次）进行实验室
28、间比对：比对样品数量至少5份，浓度包括正常和异常水平，判定标准应有80%的结果满足要求 无EQA项目使用标本为非原始标本，而是提取产物应使用临床标本监测检测全过程当实验室间比对不可行或不适用时，缺其它方法及判断检测结果的可接受性 实验室应制定评价方法，确保检测结果的可接受性（留样检测、人员比对、方法比对、与临床诊断的符合性等）对室间比对不一致的标本，未见原因分析及纠正措施应有措施进行结果确认（其他试剂、其它方法、第三家实验室等）缺实验室负责人监控室间比对或其它活动的结果 实验室负责人应监控室间比对或其它活动的结果结果有效性判断未关注标准曲线的相关系数或内参是否满足试剂说明书的要求结果有效性判断
29、除室内质控结果在控外，还应判断标准曲线的相关系数或内参是否满足试剂说明书的要求 扩增条件相同的不同检测项目扩增时共用标准曲线应使用各自的标准曲线判断结果53报告存在问题整改措施1、采集时间、接收时间、检测时 间、报告时间不完整；2、样品采集时间、样品接收时间、结果报告时间未显示实时性3、检测结果计量单位与检测下限 与试剂说明书不一致；4、个体化检测项目检测结果报告 不客观5、检测人、审核人与实际不符；6、缺少对客户必要的提示1、每份报告信息完整、准确2、样品采集时间、样品接收时间、结果报告时间应显示实时性3、个体化检测报告明确的临床意 义可在结果解释中体现4、关注检测方法的局限性54分包存在问
30、题整改措施1、未见委托实验室保证检测质量的支持性文件；2、未见相关质量评审的记录定期评审委托实验室检测质量，并有相关记录实验室缺外送检验项目的要求和规定，无外送样品的登记和记录，无委托实验室标本运送和交接过程的监控和记录 有外送检验项目的要求和规定，并做好外送样品的登记和记录，有委托实验室标本运送和交接过程的监控和记录 55投诉投诉存在问题整改措施记录简单、或5年未见投诉记录应将投诉资料及处理投诉所采取的措施及结果记录归档保存56记录记录 存在问题整改措施记录表格设计或简单或复杂实验室应有适合自身实际情况又符合现行规章制度的记录管理制度及记录表格无仪器打印结果的检验项目缺原始记录或记录不全无仪
31、器打印结果的检验项目记录信息至少应包括检测项目、试剂品牌、批号、有效期、标本唯一编号、检测结果、检测者、检测日期杂交项目记录保存有缺陷建议电子版保留仪器坏，数据丢失原始记录应定期备份，至少保留3年57 小结n材料准备不充分：人员资质不符合要求、方法学验证未做、SOP拷贝别家实验室资料n操作规程成为摆设n实验室主管、操作人员相关知识欠缺n人员内部培训欠缺或流于形式，缺培训效果的评估和员工能力的评价n仪器校准不规范n分析前质量控制问题较多n成本原因，质控措施不规范n检验报告信息不全，报告单上标本采集、接收时间与实际时间不符n记录杂、乱n外送实验室无资质，结果差异大58不符合项整改不符合项整改n整改报告规范书写 不符合/观察项事实描述、原因分析、纠正措施、预防措施、纠正措施效果确认n整改到位、整改材料有相应佐证材料如何整改，提供证据整改效果如何？n负责人认可确认59
