1、植物基因工程植物基因工程 Part I 植物基因工程概论The contributions of different methods in raising crop out-put(FAO,1998).从1983年第一例转基因植物（烟草）问世，到1993年，世界上转基因成功的植物就已突破60种；从1986年首批转基因作物获准进行田间实验，到1993年获准进行田间实验的转基因植物已达1025例，涉及38种植物。这十年是植物转基因的研究走向应用的重要准备阶段。83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02Firsttransg
2、enicplantDelay-ripening tomatoCommercialized in the USFirst field testsHerbicide resistant,insect resistant plants commercializedGM maize approved by EU First Bt corn plants Rotting resistant tomato approved by FDA 1.植物基因转移的主要方法植物基因转移的主要方法 载体为媒介的转移方法农杆菌介导的转移方法病毒为载体的转化方法 直接转移技术基因枪法花粉管通道法原生质体法PEG介导的转化
3、法2 2 农杆菌介导的转化方法农杆菌介导的转化方法 根癌农杆菌 根癌农杆菌是一种土壤微生物，在双子叶植物中导致冠瘿病的形成。冠瘿瘤的形成是由于Ti(tumor inducing)质粒导致的。2.1 2.1 根癌农杆菌根癌农杆菌 农杆菌有四种类型：章鱼碱（octopine）胭脂碱（nopaline）农杆碱（agropine）琥珀碱（succinamopine）2.1 2.1 根癌农杆菌根癌农杆菌 Ti 质粒分为4个区T-DNA区Vir区（Virulence region)Con区（region encoding conjugation)Ori区（origin of replication)2.2
4、 2.2 转化转化 利用Ti质粒将目的基因引入植物将基因插入T-DNA中，细菌就可以将它整合到植物的染色体DNA中。问题：Ti质粒分子太大。200kb的分子中无法找到单一切点的酶。2.2 2.2 转化转化双元载体策略共整合策略2.2 2.2 转化转化双元载体策略(binary vector system)双元载体系统是将T-DNA连在一个小质粒上，Ti质粒的其他的部分以正常的状态存在。2.2 2.2 转化转化共整合策略(cointegrative system)利用以pBR322或相似的大肠杆菌载体，但含有一小部分T-DNA。基因可以插入小的质粒的单一酶切位点上。2.2 2.2 转化转化 只有
5、利用“卸甲卸甲”的Ti质粒才能获得转基因植株，而不形成冠瘿瘤。使用的载体必须是表达载体。表达载体pBin192.3 2.3 发根农杆菌发根农杆菌 发根农杆菌是另一种土壤农杆菌，含有Ri质粒。Ri质粒和Ti质粒非常相似，主要的区别在于Ri质粒的T-DNA转入植物后并不导致冠瘿碱的形成，而是形成毛发状的根。2.4 2.4 病毒作为克隆载体病毒作为克隆载体 大部分的植物病毒的基因组是RNA而不是DNA。在植物上已知有两种DNA病毒花椰菜花叶病毒二价病毒（geminivirus）2.4 2.4 病毒作为克隆载体病毒作为克隆载体花椰菜花叶病毒载体:装载能力有限。寄主范围窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和
6、花椰菜等。2.4 2.4 病毒作为克隆载体病毒作为克隆载体 二价病毒自然中他侵染重要的作物，如玉米和小麦。在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。安全性。3 3 直接基因转移直接基因转移 原理：1984年发现，超螺旋结构的细菌质粒，可以重组整合到植物染色体内。3 3 直接基因转移直接基因转移代表性的方法是基因枪法火药爆炸力高压气体氦气氢气氮气高压放电基因枪转化原理基因枪转化原理 基因枪转化前基因枪转化前(A)(A)及转化后及转化后(B)(B)的主要部分示意图的主要部分示意图 AB123453.1 3.1 基因枪转化法基因枪转化法 转化率转化率差异很大，一般在10-3
7、10-2之间。McCabe在大豆上高达2%有的报道仅有10-43.1 3.1 基因枪转化法基因枪转化法 影响因素金属微粒DNA沉淀辅助剂的影响DNA的纯度及浓度对转化率的影响微弹速度的影响外植体的内在因素3.1 3.1 基因枪转化法基因枪转化法基因枪转化法的缺点成本高，转化率低嵌合体比率大遗传稳定性差3.1 3.1 基因枪转化法基因枪转化法优点：无宿主限制受体类型广泛可控度高操作简便迅速3.2 3.2 单子叶的植物基因转移单子叶的植物基因转移 农杆菌一般只侵染双子叶植物不侵染单子叶植物。植株的再生受到基因型的限制。3.2 3.2 单子叶的植物基因转移单子叶的植物基因转移 直接基因转移可以部分解
8、决着一问题。标准的方法利用原生质体，再生的困难仍然存在。基因枪转化提供了解决方法，直接将质粒DNA打到胚胎上。花粉管通道法转转BtBt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现4 受体材料的选择（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传能力；具有稳定的外植体来源；对筛选剂敏感。（2）常用受体材料的类型：l愈伤组织再生系统l直接分化再生系统l原生质体再生系统l胚状体再生系统l生殖细胞再生系统 Part II Part II 基因工程策略基因工程策略基因工程策略：基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。基因扣除：利用基因工程技术使一个
9、或多个植物已经存在的基因失活。反义技术定点突变 1 基因附加 抗虫转基因植物的培育 1.1 Bt蛋白苏云金杆菌的-内毒素苏云金杆菌在孢子形成过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白称为-内毒素，其活性很强，要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强。表1 不同-内毒素 的杀虫范围CryI鳞翅目幼虫CryII鳞翅目和双翅目幼虫CryIII鞘翅目CryIV双翅目CryV线虫纲CryVI线虫纲1.1 Bt蛋白 苏云金杆菌的-内毒素早在1904年即开始作为无公害的杀虫剂使用，但很容易降解。设想：利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定。通过基因工程赋予植物合成毒素的能力。1.2 抗虫植物培育 将-内毒素导入
10、玉米北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素(1155aa)，其29-607位的aa具有毒性。Ciba-Geigy研究小组使用了前648个密码子，人工合成了这一片段。原始基因中GC含量是38%,人工基因的GC含量为65%。1.2 抗虫植物培育将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号利用微粒轰击法将其引入玉米的胚中。胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。1.2 抗虫植物培育利用免疫技术鉴定转基因植株是否合成了-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的-内毒素数量不同，从250-1750ng/mg总蛋白。1.2 抗虫植物培育转基因植株是否对
11、玉米螟有抗性呢？应用两条标准来衡量：害虫对植株总的危害虫道的长度。转基因植株表现了较好的抗虫效果，对照虫道长度40.7cm,转基因植株虫道只有6.3cm。2 基因扣除 以延长货架期的工程番茄为例进行说明。2.1 反义技术的原理 反义技术将克隆的基因反向插入表达载体中，转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。2.1 反义技术的原理 机理不完全清楚正义和反义的RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA会很快被核酸酶降解。反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。2.2 FLAVR SAVRTM的培育 表达载体构建 1980s中期，ICI种子
12、公司生物技术部与Nottinghan大学合作，从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5端获得了一个730bp的限制性片断，包含一半的编码序列.将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。2.2 FLAVR SAVRTM的培育 植物遗传转化pBIN19分子重组到根癌农杆菌中，用来侵染番茄茎段，转移到含kan的培养基中，再生形成完整的植株。转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。2.2 FLAVR SAVRTM的培育 转基因植物的分子鉴定：Southern杂交检测反义基因Northern杂交检测反义基因的转录，利用只能与反义RNA杂交的单链
13、探针。反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响，通过与正义RNA的Northern杂交检测。结果表明，转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照。2.2 FLAVR SAVRTM的培育 转基因植物的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。转化体的鉴定转化体的鉴定 1 标记基因标记基因 2 Southern杂交或杂交或PCR扩增扩增 转基因植株中转基因植株中CryIAc基因的基因的PCR检测检测PCR analysis of CryIAc in putative transgenic plantlets转基因植株中转基因植株中CryIAc基因的基因的
14、Southern鉴定鉴定Southern assay of CryIAc in putative transgenic plants3 Northern杂交杂交 1x 5xEvent112342344 Wertern杂交或蛋白质分析杂交或蛋白质分析 5 表型选择表型选择 2.2 FLAVR SAVRTM的培育 表型鉴定转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但存放时间明显延长。意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。第三节转基因作物的遗传特点一、外源基因整合机制（一）同源重组整合（homologous recombination）外源DNA与受
15、体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。（二）位点特异性重组（site-specific recombination）在两条DNA的特异位点上，通过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。（三）转座作用（transposition）通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。（四）异常重组（illegimate recombination）异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。二、整合后的外源基因在植物体内的表现共抑制：向受体植物种导入一
16、个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表达都可能减弱的现象。基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。三、外源基因在后代中的遗传规律分离类型家系数百分率 1各位点的整合（3:1）8152 2各位点的整合 不连锁（15:1）3221 连锁（3:1,15:1）96 3各位点的整合 不连锁（63:1）96 3各以上位点（255:1）53 例外（3:1）2013合计156100第四节植物基因工程的应用 利用报告基因研究植物基因的表达与调控 利用转座元件克隆植物基因 利用转基因植物生产重组异源蛋白质 改良植物品种改良植
17、物品种生产异源蛋白 把植物改造成重要的药物或工业原料的生产工厂，即所谓的生物反应器人的血清蛋白基因转入烟草，生产医用血清蛋白；蚕丝纤维基因转入棉花，生产动物纤维等改良植物品种 延迟果实成熟 抗虫 抗病 耐除草剂 改变花型及花色 抗非生物胁迫 改善品质在世界主要的切花中都缺乏蓝色系。经过十几年在世界主要的切花中都缺乏蓝色系。经过十几年的研究蓝色康乃馨和蓝色月季的培育取得了显著的研究蓝色康乃馨和蓝色月季的培育取得了显著的进展。的进展。Suntory Ltd.Japan&Florigene Ltd.Australia花色创新花色创新花色的形成与花青素花色的形成与花青素花色形成的化学机理花色形成的化学
18、机理色素的主要类型色素的主要类型类胡萝卜素类胡萝卜素carotenoidcarotenoid 类黄酮类黄酮flavonoidflavonoid其它色素：甜菜其它色素：甜菜色素色素betalain 花色素苷花色素苷anthocyaninanthocyanin 黄酮、黄酮黄酮、黄酮醇、噢哢等醇、噢哢等 花色素花色素anthocyanidinanthocyanidin糖苷：葡萄糖、糖苷：葡萄糖、鼠李糖、果糖等鼠李糖、果糖等 蓝色花形成的主要途径：蓝色花形成的主要途径：除了液泡除了液泡pHpH值、金属离子结合和辅助色值、金属离子结合和辅助色素对花色的微调作用，增加花瓣中飞燕草色素对花色的微调作用，增加
19、花瓣中飞燕草色素苷的含量是使花瓣显蓝色的主要途径。所素苷的含量是使花瓣显蓝色的主要途径。所以以通过调节飞燕草色素苷及其衍生物合成的通过调节飞燕草色素苷及其衍生物合成的关键基因，提高花瓣中蓝色色素的含量，是关键基因，提高花瓣中蓝色色素的含量，是使花色变蓝的可行性途径之一。使花色变蓝的可行性途径之一。Pelargonidin-derivative花色素生化代谢途径及相关基因花色素生化代谢途径及相关基因flavonesflavonolsauronesDHMDHKDHQ蓝色花形成关键基因的表达分析蓝色花形成关键基因的表达分析I级级 II级级 III级级 IV级级 V 级级生长期生长期Developin
20、g stage舌状花的长度（舌状花的长度（mm）Length of ray flowers(mm)形态特征形态特征Phenotype of every stageI级5舌状花初显，瓣型针状II级58针状舌状花伸长明显高出苞片，花序呈收缩状III级1012舌状花瓣伸长变宽，瓣型略平展，花序略呈松散状，可见管状花IV级1218舌状花基本长成，完全可见管状花，花序半卷V级1620舌状花完全舒展开放CHSF3HF35HDFRrRNA I级级 II级级 III级级 IV级级 V 级级各基因在五个发育阶段的表达模式各基因在五个发育阶段的表达模式pBSFH阳性苗阳性苗花色的变化花色的变化CK萼片萼片花瓣雄蕊
21、心皮3 基因工程应用1 抗除草剂，高不饱和脂肪酸含量的转基因大豆2 耐储藏西红柿3 转富铁基因的金米水稻4 转人的血清蛋白的烟草转Xa21基因抗白叶枯病的明恢63恢复系的选育5 转Xa4,Xa5,Xa13及Xa21的多个抗性基因的累加系的选育6 抗虫玉米、棉花7 终结者技术特殊性状的遗传利用限制技术Teminator technology 种子特异启动子阻断DNA+毒素基因 重组酶，表达后可切除“阻断DNA”，其启动子是阻遏型的 编码阻遏蛋白的基因，四环素可与此阻遏蛋白结合使之失活。终止子技术是美国Delta and Pine Land种子公司和美国农业部联合申请、经美国专利局1998 年3月
22、批准的一项专利。3 基因工程应用我国基因工程产业化：抗虫棉（鳞翅目害虫抗性高达80%以上）高抗黄萎病、抗白粉病和抗赤霉病及高产、稳产的系列小麦新品种。转抗菌肽基因抗青枯病的马铃薯 抗玉米螟转基因玉米 抗白叶枯病转基因水稻 抗花叶病毒病的转基因番茄和辣椒转基因安全性争论中的典型事件转基因安全性争论中的典型事件 普斯陶伊事件普斯陶伊事件 斑蝶事件斑蝶事件第五节 转基因植物的安全性普斯陶伊事件普斯陶伊事件 早在1998 年,英国Rowett 研究所的Pusztai 宣称用转GNA 基因的马铃薯饲喂大鼠,“导致大鼠体重及器官重量严重减轻,免疫系统被损坏”。制造了著名的“Pusztai 事件”,进而在世
23、界范围内引发了转基因作物安全性的争论。斑蝶事件斑蝶事件 1999 年5 月20 日Losey 等在Nature发表了题为“转基因花粉对大斑蝶幼虫有害”的研究报告。饲养在撒有Bt 玉米花粉的马利筋叶片上的大斑蝶幼虫较之饲养在撒有非转基因玉米花粉或没有任何花粉的马利筋叶片上的幼虫取食量减小、生长延缓且死亡率更高。Bt 玉米的种植面积增加了40%,但与此同时大斑蝶的种群也增加了30%。Nature有关转基因玉米生态安全争论有关转基因玉米生态安全争论性报道的回顾性报道的回顾 陈茂叶恭银胡萃(浙江大学应用昆虫学研究所,杭州310029)生态学杂志Chinese Journal of Ecology 20
24、04,23(2):8085（1）转基因作物的环境安全性转基因作物演变为农田杂草的可能性 基因漂流到近缘野生种的可能性对自然生物类的影响（2）转基因作物的食品安全性(food safety)u有毒物质(potential toxicity)u过敏源(allergenicity of newly introduced proteins)uchanges in concentrations of key nutrients or natural toxicants.转基因产品具有一定的危险性，因此必须从对人类健康、社会安全和生态平衡的角度出发采取行之有效的措施：加强转基因产品的安全性研究建立完善的检测体系与质量审批制度加强宏观调控加强对公众的宣传和教育为公众提供良好的咨询服务规范转基因产品市场 选择性标记的安全性标记基因是否有害对环境可能的影响 转基因是一项新技术，在研究和产业化的管理和审批上采取谨慎的做法是必要的，但这种谨慎应该以科学为根据，应该以促进发展为出发点。如果审批程序过于繁琐，不科学地设卡，作茧自缚，就会限制扼杀转基因技术在我国的发展，失去让转基因技术造福于我国的良机。-张启发Thanks！
