1、This template is the internal standard courseware template of the enterprise免疫组化实验方法免疫组织化学的概念免疫组织化学的概念 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。化学。最突出的优点最突出的
2、优点 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢把结构与功能及代谢结合起来结合起来，在微观世界原位地原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能性可靠，定位准确，定量可能。免疫组化实验标本免疫组化实验标本 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档；细胞和组织的固定细胞和组织的固定1固定的作用固定的作用-使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。2选择最佳固
3、定液的标准选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10中性福尔马林液、4多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用的固定方法常用的固定方法-浸入法浸入法和灌注法灌注法（适用于动物实验研究）组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够（20倍）抗体抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克
4、隆抗体单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较：1.均一性2.稳定性3.特异性4.重复性5.沉淀反应荧光素标记抗体荧光素标记抗体 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素荧光色素。必备条件:荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小。常用的染色方法常用的染色方法 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法酶标法，亲和组织化学法 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥连法（一步法）、间接法（
5、二步法）、桥连法法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法依次为桥连法、间接法、直接法。染色的基本程序染色的基本程序标记抗体与标本中抗原反应结合；用缓冲液洗去未结合的成分；直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。反应条件反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：（1）PHPH：中性及弱硷性条件（PH 78）有利于免疫复合物的形成（2）离子强度离子强度：0.010.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成（3）去污剂去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Trito
6、n X-100（0.11%）（4）抗体稀释液中蛋白质浓度抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐剂防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐（6）温度和时间温度和时间：较高的反应温度（37）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高（7）洗涤洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇荧光素荧光素 1，异硫氰酸荧光黄异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或
7、褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490495 nm，最大发射光谱为520530 nm，呈现明亮的黄绿黄绿色色荧光。最常用。2四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。3四乙基罗丹明四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596600nm，呈橙红色荧光橙红色荧光。价廉。染色注意事项染色注意事项（1）在湿盒
8、内进行，以免标本上的试剂干燥。（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30。（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。摸索，找出最佳稀释度。（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。酶标抗体法酶标抗体法 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生
9、成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。常用的酶-辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷碱性磷酸酶酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）等。优点优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。抗生物素抗生物素-生物素生物素-过氧化物酶技术过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex avidin-biotin peroxidase complex ABC)ABC)原理原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗
10、体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：ABC-HRP ABC-HRP 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广 ABC-APABC-AP 碱性磷酸酶碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GO ABC-GO 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染ABC法的特点法的特点：敏感性强 特异性强，背景染色淡方法简便，节约时间可用于双重或多重免疫染色。免疫金染色原理免疫
11、金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。免疫组化试剂的正确选择和使用免疫组化试剂的正确选择和使用一抗一抗1.首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。减少染色背景。2.多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭加一抗前，用封闭液（可以是液（可以是BSABSA或二抗来源的正常动物血清）充分封或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断
12、非特异性结合位点。闭，以阻断非特异性结合位点。3.跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。4.正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但常常需要重新选择比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释。二抗二抗1.种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。2.注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1,可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。3.
13、正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。设立阳性对照和阴性对照设立阳性对照和阴性对照-证明实验系统的正确性1.阳性对照阳性对照：主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找原因提供重要线索。2.阴性对照阴性对照：一种是自身对照（常用），指测试组织本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织。This template is the internal standard courseware template of the enterpriseSWOTSWOT分析模板分析模板SWOT分析是市
14、场营销管理中经常使用的功能强大的分析工具，最早是由美国旧金山大学的管理学教授在80年代初提出来的：S代表strength(优势)，W代表weakness(弱势)，O代表opportunity(机会)，T代表threat(威胁)。市场分析人员经常使用这一工具来扫描、分析整个行业和市场，获取相关的市场资讯，为高层提供决策依据，其中，S、W是内部因素，O、T是外部因素。它在制定公司发展战略和进行竞争对手分析中也经常被使用。SWOT的分析技巧类似于波士顿咨询（BCG）公司的增长/份额矩阵（The Growth/Share Matrix），什么是什么是SWOT分析分析内部环境优势Strengths劣势W
15、eakness机会Opportunities威胁ThreatsSWOT分析传统矩阵示意图分析传统矩阵示意图外部环境SWOT行业分析适用范围行业分析适用范围业务单元及产品线分析竞争对手分析SWOT企业自身SBU SWOT分析SWO TSWO T企业自身SBU SWOT分析主要竞争对手SBU SWOT分析企业的内外部环境与行业平均水平进行比较当选择行业领域中只有少数竞争对手时，可以考虑做SWOT组图进行比较SWOT分析步骤分析步骤分析环境因素分析环境因素构造构造SWOT矩阵矩阵 制定行动计划制定行动计划运用各种调查研究方法，分析出公司所处的各种环境因素，即外部环境因素和内部能力因素。将调查得出的各
16、种因素根据轻重缓急或影响程度等排序方式，构造SWOT矩阵。在完成环境因素分析和SWOT矩阵的构造后，便可以制定出相应的行动计划。SW优势与劣势分析（内部环境分析）优势与劣势分析（内部环境分析）产品线的宽度产品的质量产品价格产品的可靠性产品的适用性服务的及时性服务态度竞争优势可以指消费者眼中一个企业或它的产品有别于其竞争对手的任何优越的东西。需要注意的是一定要从消费者的角度出发，寻找与竞争者或行业平均水平比较，公司的产品与服务有什么优势/劣势；而不是从公司的角度出发，衡量企业的竞争优势。通过一定努力，建立自身竞争优势引起竞争者注意，开始作出反应直接进攻企业优势所在，或采取更为有力的策略竞争优势受
17、到削弱，寻找新的策略增强自身竞争优势根据根据SW分析，公司建立并维持自身的竞争优势分析，公司建立并维持自身的竞争优势企业在维持竞争优势过程中，必须深刻认识自身的资源和能力，采取适当的措施。因为一个企业一旦在某一方面具有了竞争优势，势必会吸引到竞争对手的注意。而影响企业竞争优势的持续时间，主要的是三个关键因素：（1）建立这种优势要多长时间?（2）能够获得的优势有多大？（3）竞争对手作出有力反应需要多长时间？如果企业分析清楚了这三个因素，就会明确自己在建立和维持竞争优势中的地位了。OT机会与威胁分析（外部环境分析）机会与威胁分析（外部环境分析）环境威胁指的是环境中一种不利的发展趋势所形成的挑战，如
18、果不采取果断的战略行为，这种不利趋势将导致公司的竞争地位受到削弱。环境机会就是对公司行为富有吸引力的领域，在这一领域中，该公司将拥有竞争优势。OT机会与威胁分析方法一：机会与威胁分析方法一：PEST法法垄断法律环境保护法税法对外贸易规定劳动法政府稳定性经济周期GNP趋势利率货币供给通货膨胀失业率可支配收入能源供给成本人口统比收入分配社会稳定生活方式的变化教育水平消费政府对研究的投入政府和行业对技术的重视新技术的发明和进展技术传播的速度折旧和报废速度OT机会与威胁分析方法一：波特五力模型机会与威胁分析方法一：波特五力模型进入本行业有哪些壁垒？它们阻碍新进入者的作用有多大？本企业怎样确定自己的地位
19、（自己进入或者阻止对手进入）？购买者转而购买替代品的转移成本；公司可以采取什么措施来降低成本或增加附加值来降低消费者购买替代品的风险？供货商的品牌或价格特色；供货商的战略中本企业的地位；供货商之间的关系；从供货商之间转移的成本本企业的部件或原材料产品占买方成本的比例；各买方之间是否有联合的危险；本企业与买方是否具有战略合作关系行业内竞争者的均衡程度、增长速度、固定成本比例、本行业产品或服务的差异化程度、退出壁垒等，决定了一个行业内的竞争激烈程度构造构造SWOT矩阵矩阵SWT特快专递服务推出较早技术支持较强（如电子追踪服务以邮局为服务终端，服务网络覆盖面广O特快专递”过去的形象不太好认知率不高可
20、靠性与速度不及私营公司私营速递公司多以大公司为主要客户中小机构、个人的需求得不到满足，是个被忽视的市场香港近年经济不太景气，外部环境不利速递业竞争对手林立，正面冲突可能招致报复制订行动计划制订行动计划SWOTWT对策 最小与最小对策，即考虑弱点因素和威胁因素，目的是努力使这些因素都趋于最小。悲观 WO对策 最小与最大对策，即着重考虑弱点因素和机会因素，目的是努力使弱点趋于最小，使机会趋于最大 苦乐参半 ST对策 最小与最大对策，即着重考虑优势因素和威胁因素，目的是努力使优势因素趋于最大，是威胁因素趋于最小。苦乐参半 SO对策 最大与最大对策，即着重考虑优势因素和机会因素，目的在于努力使这两种因素都趋于最大。理想 小大大小
