1、专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,栏目链接,栏目链接,在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。,栏目链接,请思考： 1PCR技术的基本原理是什么？ 2PCR反应过程是怎样的？,栏目链接,栏目链接,1生物体内DNA复制的条件 (1)原料：_。 (2)模板：解旋后的每一条_。 (3)酶：打开DNA双链的_和合成DNA单链的_。 (4)引物：为DN
2、A聚合酶的起始提供_末端。,一、PCR的原理及反应过程,4种脱氧核苷酸,DNA母链,解旋酶,DNA聚合酶,3,栏目链接,2PCR扩增的原理 (1)概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种体外_的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 (2)原理： DNA变性：在_的温度范围内，DNA的_结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。,迅速扩增DNA片段,80 100 ,双螺旋,栏目链接,DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新_，这个过程称为复性。 DNA合成：DNA聚合酶从引物_端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的_端向_端延伸。,结合
3、成双链,3,5,3,栏目链接,(3)条件： 模板：解旋后的每一条_。 引物：能分别与_结合的两种引物。 原料：_。 酶：_DNA聚合酶。 其他条件：需要稳定的_和能自动调节温度的温控设备。,DNA母链,两条模板链,4种脱氧核苷酸,耐热的,缓冲溶液,栏目链接,90 ,50 ,碱基互补配对,栏目链接,72 ,DNA聚合酶,碱基互补配对原则,栏目链接,1实验用具 (1)PCR仪：该仪器能自动调控_，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个_水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为_mL，实际上是进行PCR反应的场所。 (3)微量移液器：用
4、于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。,二、PCR的实验操作,温度,恒温,0.5,栏目链接,2实验步骤,用微量移液器,轻轻弹击,栏目链接,10,栏目链接,3DNA含量的测定 (1)原理：利用DNA在_的紫外线波段有一强烈的吸收峰。 (2)计算公式： DNA含量(g/mL)_稀释倍数。 点拨：在PCR实验操作中，常用微量离心管作为反应场所，在操作时，用微量移液器按照PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。,260 nm,50(260 nm的读数),栏目链接,栏目链接,一、生物体内的DNA复制与PCR反
5、 应的比较,栏目链接,DNA单链有方向性，DNA母链的3端对应着子链的5端，即DNA的两条链是反向平行的。 注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。 DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。,特 别 提 醒,栏目链接,例1标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( ) A92 、50 、72 B72 、50 、92 C50 、92 、72 D80 、50 、72 ,栏目链接,解析：当温度上升到90 (9096 )
6、以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 (4060 )左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 (7075 )时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。 答案：A,栏目链接,变式 训练,1DNA的复制需要引物，其主要原因是( ) A可加快DNA的复制速度 B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合 C引物的5端有助DNA聚合酶的延伸DNA链 DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链,栏目链接,变式 训练,解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常
7、将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从5端开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 答案：D,栏目链接,二、PCR技术的基本原理,类似于DNA的天然复制过程，由变性复性延伸三个基本反应步骤构成： 1模板DNA的变性 模板DNA经加热至95 左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2模板DNA与引物的退火(复性) 模
8、板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,栏目链接,栏目链接,3引物的延伸 DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为反应原料，DNA母链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性复性延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 min,23 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,栏目链接,PCR扩增过程中的易错点 PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热
9、变性后是DNA单链，并未分解成单体。 复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。,特 别 提 醒,栏目链接,三、PCR的实验操作,1操作步骤 (1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。 (2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。 (3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 (4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。,栏目链接,(5)将离心管放在PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 以上过程可以概括为准备、移液、混合、离心、反应五大步。,栏目链接,2实验结果与分析 (1)实验中DNA含量的测定。 稀释：取2 L
10、 PCR反应液，加入98 L蒸馏水，即将样品稀释了50倍。 对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。 测定：取DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。 计算：DNA含量(g/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。,栏目链接,(2)理论上DNA扩增数目的计算。 DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a2n个DNA。 (3)DNA扩增是否成功。 检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布
11、及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。,栏目链接,例2下列操作过程的叙述中错误的是( ) APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存 CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换,栏目链接,解析：从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。 答案：C,栏目链接,2在PCR实验操作中，下列说法不正确的是( ) A在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头 B离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢 C用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合 D离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果,变 式 训 练,栏目链接,解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。 答案：A,变 式 训 练,栏目链接,
