1、细胞细胞DNADNA倍体倍体分分析技析技术术在妇科肿在妇科肿瘤瘤 检测中的应用检测中的应用妇幼医院管理案例内容简介内容简介细胞细胞DNA倍倍体分析技体分析技术术原原理理细胞细胞DNA倍倍体分析技体分析技术术在在宫颈宫颈癌癌检检测中测中的的应应用用 细胞细胞DNA倍倍体分析的体分析的其其他他应应用用临临床床取取材材及及报告解报告解读读癌症病因探讨癌症病因探讨染色体倍体理论在所有已知的肿瘤中，承载着数千个基因的染色体伤痕累累 复制失常、屡屡断裂、结构重排甚至整体缺失。越来越多的证 据显示，染色体的混乱状态并非恶性转化的副作用，而是癌症 发生的直接原因和推动力。染色体数目与结构的改变足以引发某种癌症
2、，而单个基因的突 变则没有如此强大的力量。彼彼得得迪迪斯斯贝贝格（格（Peter Duesberg）发表于2007年环球科学杂志第6期“医药科学”栏目染染色色体体整倍整倍性性出现在正常、出现在正常、炎炎 症症、化化生以生以及及增生的细增生的细胞胞染染色色体体非整非整倍倍性出性出现现 在在几几乎乎所有所有癌癌细细胞胞癌症是一癌症是一种种DNA的疾病的疾病：非整倍体程度加重，蛋白质合成紊乱，非整倍体程度加重，蛋白质合成紊乱，细细胞胞呈呈现恶现恶性性特征，出现形态改变和异特征，出现形态改变和异常常增殖，最终形成肿瘤增殖，最终形成肿瘤。检测细胞DNA的改变是监测肿瘤发生发展最有效手段首先是细胞DNA改
3、变（非整倍体细胞）细胞内DNA异常到一定程度出现细胞形态改变肿瘤发生的机理DNADNA筛查健康体检应用筛查健康体检应用可应可应用用于包于包括括肺癌、肺癌、口腔口腔癌、宫癌、宫颈颈癌癌、膀胱膀胱癌癌等体等体检检筛查筛查。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一DNADNA技术应用于宫颈癌检测技术应用于宫颈癌检测宫颈癌致病及高危因素宫颈癌致病及高危因素行为因素行为因素-过过早早性性行行为为，多多性性伴伴侣侣，性性紊紊乱乱 生物因素生物因素-病毒因素病毒因素：HPV（Human papillomavirus，人乳头状瘤，人乳头状瘤 病毒）感病毒）感染染,HSV感感染染,MCV
4、感染等感染等-宿主因素宿主因素：性传性传播播疾疾病病(Sexually transmitted diseases，STDs)，免疫系统水平低下，服用复合避孕免疫系统水平低下，服用复合避孕药药等等-环境协同环境协同因因素素 遗传易感性遗传易感性宫颈癌筛查历程宫颈癌筛查历程巴氏涂片巴氏涂片液基薄层制片液基薄层制片形态学形态学+辅助诊辅助诊 断方法断方法TCT(膜式）膜式）LCT(沉降）沉降）计算机图像分计算机图像分 析析（DNA倍体）倍体）形态学诊断形态学诊断HPV检测检测LPT(界面化学）界面化学）其他其他巴巴 氏氏 检检 查查最早的防最早的防癌癌检检查查George N.Papanicolao
5、u（1883-1962）巴氏涂片巴氏涂片有有5050余年的应用历史，用取材器从余年的应用历史，用取材器从 宫颈上皮的移行区采取标本并涂于玻片上，宫颈上皮的移行区采取标本并涂于玻片上，细胞经巴氏染色后镜下观察形态细胞经巴氏染色后镜下观察形态液基液基细细胞学胞学和和巴巴氏氏涂片涂片意大利 临床试验 22466:巴氏涂片 22708:液基细胞学 CIN 2 Sensitivity（敏感性）相等 Specificity（特异性）降低 CIN 1 敏感性提高Ronco G,et al,2007.BMJ液基液基解决了解决了制制片问片问题题，但但不能不能从从根根本本上上降降低漏低漏诊诊和和误误诊诊传统诊断细
6、胞学的局限性传统诊断细胞学的局限性 制约制约细细胞学诊断质量的客观因素胞学诊断质量的客观因素1.1.来来自自送检临床方送检临床方面面的因的因素素；2.2.来来自自标本制作技标本制作技术术方面的因素方面的因素 。制制约约细细胞胞学医生学医生诊诊断质量的主断质量的主观观因素因素1.1.经验及主观认识上经验及主观认识上的的差差异异；2.2.疲疲劳劳等其他因素。等其他因素。形形态态学学的补的补充充方法探方法探讨讨简简单、经济单、经济、高高效效子宫颈癌是目前唯一病因明确的癌症，HPV感染是宫颈癌及其癌前病变 的最主要病因。HPVHPV：200200 多种多种亚亚型型,根根据其据其致致癌癌性性的大的大小小
7、分分为为两两类类：低危型低危型：HPV6HPV6，1111，4242，4343，4444等等，常引起常引起外外生殖器生殖器湿湿疣等疣等良良 性病变。性病变。高危型高危型：HPV1HPV16 6，1 18 8，3 31 1，3333，5 52 2，5 58 8，等，等，与宫颈癌及与宫颈癌及其癌其癌前前病变有病变有关关。一、一、HPHPV V人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒妇科细妇科细胞胞病病理学诊断与临床处理学诊断与临床处理理赵澄泉赵澄泉、杨、杨敏敏HPV感染是自限性疾病，大部分感染HPV病毒的病人可以自愈，只有极 少数发展为宫颈癌；70%以上的感染人群在30个月内自愈，感染人群 中致癌率不足1%。AS
8、CCP指南：指南：细胞学正常细胞学正常的的HPV感染率感染率二、细胞二、细胞DNADNA倍体分析倍体分析（计算机辅助诊断技术）（计算机辅助诊断技术）通过通过DNA病变检测早期病变检测早期 肿肿瘤瘤细细胞，胞，是是一种定量一种定量的的 检测技检测技术。术。20092009年年获获得中华医学会得中华医学会病病 理理学学分分会认会认证证。采用细胞采用细胞DNA倍体分析系统检测进行细倍体分析系统检测进行细 胞扫描。胞扫描。分分析析其染色情况，具备准确其染色情况，具备准确、客观、简客观、简便便、高效的特点高效的特点。原位癌和浸润癌的癌 细胞巴氏：第一个建议通过巴氏：第一个建议通过测量细胞核测量细胞核DN
9、ADNA含量检测肿瘤细胞含量检测肿瘤细胞细胞细胞DNA倍体分倍体分析析检检测测与与HPV检检测测的的区区别别HPV-DNA检测HPV病毒感染和患病风险；细胞DNA倍体检测体细胞的DNA含量，DI2.5（细胞DNA含量5C）即为病变细胞。正常宫颈细胞的恶性转化正常宫颈细胞的恶性转化1.HPV-DNA整合到细胞核DNA上2.病毒蛋白E6/E7干扰中心体合成3.纺锤丝缺陷4.最初的，较少的非整倍体细胞5.进一步，严重的非整倍体细胞6.恶性转化HPV-16 E6/E7：中心体中心体数数目目异异常常HPV-16 Onkoproteins E6/E7:Wrong Number of Centrosomes
10、E7:由于错误的中心粒导致中心体加倍出错E6:多余的中心体导致有丝分裂呈现多极化并产生异倍体Duensing und Mnger:Human papillomaviruses and centrosome duplication errors:modeling the origins of genomic instability.Oncogene 21,6241-6248(2002)HPV检测与DNA倍体分析的对比检测对象液基标本或宫颈分泌物检测时间：2-6h 临临床意义：床意义：病病毒毒检检测。测。阳性代表为病毒感染和患病风险。检测对象液基标本检测时间：5小时左右 临床意义病病变变检检测测。
11、阳性说明有病 变细胞。死亡死亡癌前癌前5-10年年癌症癌症宫颈癌病变时间历程高危型高危型HPV感染感染细胞核细胞核DNA改变改变细胞形态细胞形态 出现变化出现变化检测方法检测方法检测靶标检测靶标检测意义检测意义特点特点巴氏涂片巴氏涂片/液液 基细胞学基细胞学宫颈上皮细胞宫颈上皮细胞提示宫颈细胞提示宫颈细胞 已发生的病变已发生的病变 情况情况形态学，定性检形态学，定性检 测，敏感性低测，敏感性低HPV病毒检病毒检 测测HPV病毒病毒DNA提示是否有高提示是否有高 危病毒感染危病毒感染敏感性高，特异敏感性高，特异 性低性低细胞细胞DNA倍倍 体检测体检测细胞细胞DNA异倍异倍 体体提示早期细胞提示
12、早期细胞 病变病变敏感显著高于巴敏感显著高于巴 氏涂片，特异性氏涂片，特异性 高于高于HPV几种常见宫颈癌检测方法比较各种肿瘤检测技术各种肿瘤检测技术体细体细胞胞基因基因突突变变体细体细胞胞染色染色体体紊紊乱乱蛋白蛋白表表达改达改变变细胞细胞增增殖分殖分化化异异常常细胞细胞形形态改态改变变癌癌PCR基因芯片基因芯片FISH、核酸、核酸原位杂原位杂交交FCM(流式流式)ELISA、免疫细胞、免疫细胞/组织化学、组织化学、Western、胶胶体体金金/荧光标记、荧光标记、生化检测生化检测常规细胞学、组织学常规细胞学、组织学组织学、影像学组织学、影像学HPV（宫颈癌）（宫颈癌）致癌致癌因因素作素作用
13、用DNA-ICM（定量）（定量）Step1Step1：对细胞标本进行对细胞标本进行 特殊染色特殊染色（DNDNA A特异性特异性 染色）染色）S St tepep2 2:：自动扫描，：自动扫描，收集标本片上所有收集标本片上所有 细胞细胞细胞细胞DNADNA定定量量（倍倍体体）分析分析流流程程step3:step3:分分析析扫描数据（扫描数据（细细胞胞核核DNADNA倍倍体体变化）变化）DNA报告报告（阳阳性性）异异 倍倍 体体 峰峰增生增生细细胞胞10%DNA倍体倍体 异异常细常细胞胞（DI2.5）正常细胞正常细胞为为参参照照 细胞，细胞，DI=1（2C）扫扫描描 数据中，数据中，DI值值2.
14、5（倍体大（倍体大于于5C的）的细的）的细 胞胞为为倍倍体异体异常常细胞，细胞，其其DI 用红色显用红色显示示；DI值在值在1.25-2.5之间时之间时（倍体（倍体2.5C-5C)，他，他们们既既 可可能能是是病变病变的的，也可能，也可能是是 处处在在有有丝分丝分裂裂周期中周期中；DI1.25（倍倍体体2.5C以下以下 时），扣时），扣除除系系统误差，统误差，它它 们们通通常常是静是静止止期分化成期分化成熟熟 的细胞。的细胞。4c6c8cG2(分裂期)的二倍体细胞或3倍 体的增殖细胞1c2c3cG0期的2倍体细胞(with errors)2c3c8c1c4c5c 6c细胞周期中的2倍体细胞 或
15、G0期的非整倍体细胞当DNA含量 5c（DI=2.5)，超过了正常细 胞分裂的倍体变化，应考虑为异常细胞DNA-ICM直方图示意DNA异倍体情况diploidPolyploid多倍体Aneuploid异倍体Dipolid二倍体阳性阳性DNA报报告的告的结结果果判判读读DNADNA倍体与其他检测技术结合倍体与其他检测技术结合 TBS+细胞DNA倍体 HPV+细胞DNA倍体？DNAf 8ss7*J AB6B i,frJ.i t Ji+EsB.l3EtA(t”)B ,v p 9.z p i t I a 6(+),9l 3EBf6IIJ tiAB:JIik DNADNA定量分析定量分析+细胞形态学联合
16、诊断细胞形态学联合诊断有有效效提高检测阳提高检测阳性性率，减少漏诊率，减少漏诊地区地区 组织单位组织单位筛查技筛查技术术细胞学细胞学结果结果筛查总筛查总人数人数细胞学细胞学异常异常细胞学异常之组织学结果细胞学异常之组织学结果CIN2CIN1正常（慢性正常（慢性 宫颈炎）宫颈炎）上海上海上海交通上海交通 大学附属大学附属 仁济医院仁济医院新柏氏新柏氏 TCTASCU S62941011620441.60%20.00%25.00%55.00%云南云南 曲靖曲靖国际和平国际和平 妇幼保健妇幼保健 院院新柏氏新柏氏 TCT6116130714242.12%15.56%31.11%53.33%广州广州南
17、方医科南方医科 大学南方大学南方 医院医院新柏氏新柏氏 TCT610713982362.27%69.49%30.51%厦门厦门 两癌筛查两癌筛查TBS+DNA倍体倍体DNA3 8155625543393806203.13%25.32%28.40%46.30%20122012年年全全国国妇妇科科年年会会妇妇科科肿肿瘤瘤分分会会 数数据据对对比比各种筛查各种筛查技技术术发现发现CIN2+病变的灵敏病变的灵敏度度和特异和特异度度筛查方法类型/原理灵敏度*特异度*备注*HPV-DNA检测 HC-280%98%61%95%9(13568497)PCR75%89%790%96%3(19954761)*细胞
18、学Pap smear37%84%87%98%12(135611085)*液基细胞学（LBC）69%88%81%97%3(7448489)DNA倍体分析 DNA-ICM94.84%98.76%1(132327)联合筛查DNA-ICM,LBC98.28%98.65%1(132327)HC-2，Pap smear 86%100%76%95%5(135620810)*HC-2,LBC92%93%1(1997)PCR,LBC91%88%1(8551)注：引自Cervix cancer screening,IARC Handbooks of Cancer Prevention,IARC 2005HPV-D
19、NA和和DNA异倍体异倍体HR-HPV感染与宫颈癌的发存在必然关系，但人群中HR-HPV感染率较高，且大多数HR-HPV感染为暂时性的可自行恢复，尤其是年轻女性。只有持 续性感染导致宿主细胞病毒癌基因E6、E7高表达，最终引起多倍体和非 整倍体细胞出现，才会导致宫颈癌的发生。因此，正常的DNA倍体分布可能是短暂的HPV感染和复原的信号。而异常的DNA倍体分布则暗示持续的HR-HPV感染。有研究证明，HR-HPV感染与出现DNA含量大于9C细胞的不典型鳞状 细胞直接相关，而且不管细胞学检查的结果如何，9C细胞的出现联合HR-HPV感染可以有效预测宫颈疾病的发展。基于宫颈癌流行病学的研究成果和肿瘤
20、生物学特征，DNA倍体分析联合HR-HPV检测预测宫颈CIN可以有效地提高CIN的检出率。对于细胞学对于细胞学为为ASCUASCUS S或或L LS SI IL L,而无而无DNDNA A异倍体的病例异倍体的病例,建议其定建议其定 期复查期复查,阴性预期值为阴性预期值为95%95%对于细胞学对于细胞学为为ASCUSASCUS或或LSIL,LSIL,有有DNADNA异倍体异倍体,2,2个月后检测个月后检测出出CIN3 CIN3 以上病变的阳性预期值以上病变的阳性预期值为为46%46%。-Boecking A.et al.Cancer Cytology.2004,102DNA-ICM在妇科肿瘤检测
21、中 的其它应用（一）典型病例随访典型病例随访 叶某某，女，33岁，福建漳州某医院时间时间细胞学细胞学DNADNA定量分析定量分析活检活检2011.32011.3阴性阴性阴性阴性2012.42012.4阴性阴性可疑（可疑（4 4-6 6个月复查）个月复查）2012.72012.7提示细菌性阴提示细菌性阴 道病道病阳性（建议活检）阳性（建议活检）慢性宫颈炎伴慢性宫颈炎伴C CI IN N-级，级，2012.92012.9阴性阴性可疑（可疑（4 4-6 6个月复查）个月复查）2013.22013.2ASCUSASCUS阳阳性性（建建议活检）议活检）慢性宫颈炎伴慢性宫颈炎伴CINCIN级级,累及腺体累
22、及腺体2013年年2月月 典型鳞状上典型鳞状上 细细胞胞，建建议议 诊断为慢性诊断为慢性第五次第五次检查结果检查结果：宫颈细宫颈细胞胞学诊断为意义不明确的学诊断为意义不明确的非非皮皮细胞，细细胞，细胞胞DNA定量分析可定量分析可见见5个个DNA倍体异常倍体异常 临临床阴道镜检查和活体组织床阴道镜检查和活体组织检检查，活检查，活检取取4个点位，个点位，宫宫颈炎颈炎伴伴CIN级级。DNA-ICM的应用（二）恶性程度的评估 DNA异倍体在不同分化程度的鳞状细胞癌 中出现的比率不同分化较好：64%分化中等：71%分化较差：83%85%的腺癌中DNA异倍体峰出现。-Kashyap V.et al.J P
23、athol Microbiol.2000;43:265-269DNA-ICMDNA-ICM的其他应用（三）的其他应用（三）治治疗疗方案的选择方案的选择*DNADNA异异倍倍体病例对体病例对放放疗更加敏感疗更加敏感放放疗疗后疗效评估后疗效评估*异异倍倍体细胞减少，异倍体体细胞减少，异倍体峰峰消失消失指指导导有癌前病变有癌前病变的的怀孕妇女的怀孕妇女的随随访和临床处访和临床处理理*1.Davey DD,et al.Cancer Cytopathol,1998,84:11-162.Biesterfeld S.et al.Cancer Cytopathol,2001,93:160-164细胞细胞DNA
24、定量分定量分析析技技术术的的 临临床应床应用用宫宫颈颈癌癌及癌及癌前前病变的诊病变的诊断断；DNA和和TBS检测或检测或HPV检测检测联联合的分流作用合的分流作用；为肿瘤的为肿瘤的恶恶性性程度评估提供参程度评估提供参考考；对对宫宫颈颈疾病疾病发发展趋向的预测和疗效的评展趋向的预测和疗效的评估估；宫颈标本取材宫颈标本取材宫颈移行宫颈移行带带（病变高发区病变高发区）窥阴窥阴器充分器充分暴暴露宫露宫颈颈，将将刷头刷头中中央央较较长长刷刷丝从丝从宫宫颈颈外外口插口插入入宫宫颈颈管管内内，两，两边边 较短较短刷丝抵刷丝抵住住宫颈宫颈粘粘膜膜面面，横，横放放于于3 3、9 9点点位置位置，顺顺时时针针或或
25、逆时逆时针针旋旋转转3-53-5圈，圈，力力度适宜度适宜。宫颈刷取材方法宫颈刷取材方法影响影响检测质检测质量量的因的因素素通通常常为标为标本本质质量量太太差差（上（上皮皮细细胞胞过少过少，粘粘液液、血血细胞细胞、炎细炎细胞过多胞过多）或者或者刮刮取取手手法不法不当当，取取到到了了太多太多处处于于正正常细常细胞胞周周期期的的细细胞造胞造成成 假阳假阳性性。妇妇科取材注科取材注意意事事项项1、取材前阴道、宫颈不得使用任何润滑剂2、取材前如果宫颈口有较多粘液，可以轻轻擦拭3、经期及妊娠早期妇女不宜筛查4、如临床发现可疑宫颈癌的临床体征，应立即活检5、病人在受检前48小时,不得作阴道冲洗及任何阴道 治
26、疗或使用避孕剂6、急性宫颈炎及各种阴道炎的急性感染期,可经治疗 后再作检查7、宫颈癌手术及放化疗后，建议间隔1年以上再复查；Leep术后建议间隔3个月以上再复查。DNA倍体检测在其他妇科肿瘤倍体检测在其他妇科肿瘤中中的的 应用应用子宫内膜癌子宫内膜癌影响检测的因素：细胞取样病变细胞成团子子宫宫内内膜膜细胞采集细胞采集DNA定定量量在在乳腺导管乳腺导管非非典典型增型增生生与与原位原位癌癌诊诊断中断中的的应应用用细胞细胞DNA定定量分析系量分析系统统CFDA认证认证医疗许可证（CFDA）：细胞保存液与染色试剂权威技术鉴定：中华医学会病理学分会北京协和医院北京军区总院北京海军总院首都医科大学附属北京
27、口腔医院上海同济医院上海第二军医大学附属长海医院上海复旦大学附属中山医院上海市第一人民医院上海市闵行中心医院中山大学附属第三医院广州市第一人民医院南方医科大学附属南方医院广州医学院第三附属医院广州华银病理诊断中心网点覆网点覆盖盖20多个省、市、自治区，多个省、市、自治区，近近500家网家网点医院点医院。全国部分采用全国部分采用DNADNA技术开展肿瘤检测的实验室技术开展肿瘤检测的实验室卫卫生生部部部长部长陈陈竺在鄂尔多斯及郑大一附竺在鄂尔多斯及郑大一附院院A Member or the Speed Folr Group2014年12月27日，在北京协和、北京 医院、军区总院召开的专题DNA技术 学术交流会
