1、食品（饲料）中氨基酸的测定王金娥 目录目录一、一、氨基酸分析仪简介氨基酸分析仪简介 二、氨基酸 三、氨基酸分析仪基本分析原理 四、氨基酸分析仪法与HPLC的比较 五、样品的制备 六、影响氨基酸分析的各种因素 七、应用日立氨基酸分析仪简介日立氨基酸分析仪简介一、氨基酸分析仪：（一）氨基酸分析仪的构成（见图1)（二）氨基酸分析仪的流程图（见图2)（三）特点日立氨基酸分析仪的构成、流程图及特点日立氨基酸分析仪的构成、流程图及特点（一）氨基酸分析仪的构成 1、输液单元（泵与管路）作用：输送缓冲液、反应液在流路系统中流动。2、进样单元（自动进样器）作用：将样品在流动相的带动下送入仪器体系中。3、分离单元
2、（离子交换柱、柱温箱）作用：主要是样品的分离、将混合的样品分离成单一组分。4、反应单元（反应柱、反应温度加热设备）作用：被分离的单一组分物质与反应液在反应单元反应、生成可检测物质。5、检测单元（分光光度计）作用：准确检测单一组分物质的电能信号（mv).6、程序控制、数据处理（工作站）作用：仪器的运行程序控制、检测结果的处理。从图、表面看（1）自动进样器（2）泵1、泵2单元（3）电磁阀（4）除气（5）废液槽（6）检测器（7）氮气单元（8）柱温箱（9）过滤器（10）混合器（11）反应柱单元（12）试剂和清洗液（13）保护罩。左侧：电源开关。后部 通讯接口、电源连接器、氮气源连接器。(二）氨基酸分析
3、仪流程图 见图（2）（三）日立氨基酸分析仪特点氨基酸氨基酸 二、氨基酸 （一）氨基酸的定义 （二）氨基酸的分类 （三）氨基酸的化学性质 自然界中的氨基酸种类很多，但组成蛋白质的氨基酸只有20多种，从结构式上来看组成蛋白质的氨基酸除甘氨酸以外，都有一个不对称碳原子、即a-碳原子，a-碳原子有四个不同的取代基：COOH羧基、NH2氨基、H氢原子、和R基团，不同氨基酸的R基团不同。氨基酸的R基团又称为侧链，由于不同氨基酸的侧链不同它们的分子量、解离程度和化学反应、性能均不同。除甘氨酸外每种氨基酸都有L-构型、D-构型。蛋白质中的氨基酸都是L-型的，从形状 上看氨基酸是无色的结晶物质，它们在水溶液中显
4、中性、微酸性或微碱性。蛋白质成分中任何氨基酸均可用图中的通式来表示（脯氨酸除外）：见下图（一）氨基酸的定义（一）氨基酸的定义 （略）（略）（二）氨基酸的分类 它的分类有两种：1.按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：2、按人体营养的需求又可分为必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸（三）氨基酸的化学性质 氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基（SH)氨基酸的化学反应 与茚三酮反应：茚三酮与氨基酸一起加热，形成深兰紫色复合物,最大吸收波长为570nm与与茚茚三三酮
5、酮反反应应氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解产氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解产 生生CO2CO2、氨和比氨基酸少一个碳原子的醛，、氨和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。在弱酸性溶液中，还此时茚三酮被还原。在弱酸性溶液中，还 原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成蓝原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成蓝 紫色化合物茚二酮胺（紫色化合物茚二酮胺（DYDADYDA）DYDADYDA在在570nm570nm 处有最大吸收。处有最大吸收。脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物 质，在440nm处吸收峰最大。除氨基酸以外，如NH2肽类也可与茚三酮反应 生成有色物质（这种反应机理现应用于我们 使
6、用的氨基酸分析仪之中）。氨基酸分析仪分析原理氨基酸分析仪分析原理三、氨基酸分析仪基本分析原理 （一）离子交换柱 （二）离子交换树脂 （三）离子交换原理 （四）氨基酸分析仪洗脱过程氨基酸分析仪与氨基酸分析仪与HPLC法的比较法的比较四、氨基酸分析仪与HPLC法的比较 （一）OPA法（邻苯二甲醛）（二）PITC法 （三）DCL法 （四）2-4二硝基氟苯法 氨基酸分析氨基酸分析仪仪与与HPLC常常规规比比较较样品的制备样品的制备五、样品的制备 （一）蛋白质的水解 （二）游离氨基酸样品的制备 （三）生理体液样品的前处理（一）蛋白质的水解：用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，
7、水解方法有三种：1、酸水解法：标准水解法，是普遍采用的水解方法，此方法的特点是水解彻底，但色氨酸遭破坏。（6N HCL、110真空水解24小时）优点：HCL本身加热可以蒸发除掉。缺点：溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。2、碱水解法：用NaOH(LiOH、Ba(OH)2)作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、胱氨酸遭不同程度的破坏。优点：水解液清亮。缺点：放出氨气和硫化氢.3、酶水解法：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。特点是水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类；此方法主要用于生产
8、水解蛋白及蛋白肽。缺点：水解时间长、而且不易水解完全。目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺均为酸水解法。（二）游离氨基酸样品的制备 游离氨基酸的样品在分析前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18过滤柱处理一下为好。（三）生理体液样品的处理：生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为：1、苦味酸法 用1%的苦味酸沉淀，然后过柱子除苦味酸，在把氨基酸从柱子上洗脱下来进行分析。2、三氯醋酸法 生物碱沉淀剂医院临床生化、常用此类试剂沉淀血浆中的蛋白质。3、乙醇沉淀法 当乙醇加入含蛋白质的水溶液中，可使蛋白质表面失去水
9、膜，并增大颗粒间的引力，引起蛋白质沉淀。4、磺基水杨酸法（常用的方法）影响氨基酸分析的各种因素影响氨基酸分析的各种因素六、影响氨基酸分析的各种因素（一）样品中氨基酸浓度的影响（二）缓冲液PH值、钠离子浓度的影响（三）柱温的影响（四）氨的影响（五）氧存在的影响（六）光源的影响（钨灯）应用应用七、应用 （一）医学上的应用 （二）饲料上的应用 （三）农业、食品、饮料及其它氨基酸自动分析仪法测定食品（饲料）氨基氨基酸自动分析仪法测定食品（饲料）氨基酸含量酸含量 1.原理 食品（饲料）蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基
10、酸含量。2.试剂 3.仪器 4.测定方法 5.结果计算酸水解原理与步骤酸水解原理与步骤氧化水解原理与步骤碱水解原理与步骤水解技术水解技术水解方式：真空（充N）封管法 开放式回流水解法 培养管水解法培养管水解法培养管水解法氮吹仪氮吹仪水解液蒸干技术水解液蒸干技术冷井杜瓦瓶冷井杜瓦瓶-196液氮液氮氨基酸标准溶液谱图氨基酸标准溶液谱图Minutes0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.0mV0102030405060mV01020304050604.607 Asp5.267 Thr5.840 Ser6.467 Glu7.147 9.293 Gly9.873 Ala12.153 Cys12.573 Val13.687 Met14.367 15.820 Ile16.880 Leu18.220 Tyr19.707 Phe21.960 Lys22.907 NH323.800 His27.120 ArgProVIS 1Retention TimeNameVIS 2Name 氨基酸分离技术在各个领域中应用非常广泛，已成为我国科学领域中必不可少的一种检测手段。谢谢大家！
