1、实验三实验三 悬浮细胞与贴壁细胞悬浮细胞与贴壁细胞 的培养与观察的培养与观察细胞培养的基本概念n 细胞传代细胞传代：n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。n细胞系 cell linen细胞株 cell strain 培养细胞的特性n 培养细胞的生长方式n贴附生长：n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞n悬浮生长：n 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）n游离期：n 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n
2、 10分钟一4小时n贴壁期：n 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）n潜伏期n 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一n般为624小时。n对数生长期：n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。n停止期（平台期）：n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n 机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的
3、条件n1 细胞的营养需要n2 细胞的生存环境n 温度:37 n O2n CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-n pH:7.2-7.4n 渗透压n 3 无污染n 4 无毒 实验准备实验用品：实验用品：n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸nCO2培养箱n倒置显微镜n酶标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪n耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广n电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃n器皿消毒 n滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、n酶液
4、等均采用滤过法除菌 n超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料n培养皿和培养板等表面消毒 n 无菌细胞培养室其它物品细胞冻存管超净台n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤 器 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。n 箱内灭菌蒸馏水3000毫升，以保持箱内湿度
5、，避免培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板 培养瓶n 常用玻璃器皿清洗n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干清洁液的配制2 细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 mln消化液：n 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞
6、骨架，从而使细胞分离。n n 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。n天然培养基：天然培养基：n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。n优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限。n 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。n 易发生支原体污染 合成培养基n 合成培养基
7、是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。n 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。n 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。n 成本低 n 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。n 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。n血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子 激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n一般说来含5小牛血清的培养
8、基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清n血清中不仅存在促细胞生长因子，提供细胞体外适于生存的微环境n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌n抗菌素的使用：n 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。n 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100u。完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清
9、5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素 各100卑位毫升完全培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）细胞传代方法n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：n 1 悬浮生长细胞传代n 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。n2 半悬浮生长细胞传代n 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱
10、落下来，进行传代。n3 贴壁生长细胞传代n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。一、实验目的n1.掌握观察体外培养细胞的形态及生长状况的方法。n2.掌握细胞传代的方法。二、实验原理n细胞传代培养是指细胞从培养瓶以大于或等于1：2的比例转移，接种到另一培养瓶的操作过程。传代后的细胞生长密度降低，可获取新鲜培养基中的丰富营养，有利于细胞在体外环境更好的生长与繁殖。三、实验器材与试剂n1.材料：悬浮细胞、贴壁细胞n2.器材与仪器：刻度吸管、吸球、橡皮吸头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）、华氏管等。（上述器材需彻底清洗，玻璃器材160C烤干或塑料器材烘干，包装后高压蒸汽灭菌30min或辐照
11、灭菌，备用。）超净工作台、倒置显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、废液缸等。n3.试剂：无钙镁PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。四、实验内容n1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75%的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液放置室温，备用。3）打开超净台内的紫外灯，照射20 min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。n2、关闭超净台的紫外灯，打开风机。n3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。n4、在打开培养瓶之前，用酒精
12、棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。加入无钙镁PBS洗涤细胞，再用吸管吸去液体。n5、对于贴壁细胞的传代培养方法，将0.25%胰酶加入培养瓶内，显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失、细胞变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶。记住不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。n6、加入适量无钙镁PBS或培养基清洗一遍，立即倒掉。n7、加入含有10%血清的培养基，用吸管吹打细胞，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，在瓶外注明细胞名称、日
13、期、实验人员姓名等，放入CO2培养箱中进行培养。n对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000 rpm/5 min，然后，换入新的培养基即可，再分装到不同的培养瓶中进行培养。n不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大、变形、不规则，失去原有的特点。n8、结果观察n一般情况下，传代后的贴壁细胞在2h后贴壁，24d可在瓶底形成单层，需要再次进行传代。n细胞培养过程中，需要每天在倒置显微镜下进行观察，重点注意以下几点：n1）观察细胞是否污染。注意培养液的颜色变化与澄清与否。n2）观察细胞是否增殖，细胞密度是否发生变化。n3）观察细胞形态特征。n4）对活细胞占细胞总数的
14、比例，可用0.5%台盼蓝染液进行染色。五、注意事项n注意每个操作环节，严格防止细胞污染。传代或换液24 48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。细胞生长曲线的测定（示教）n原理：n生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。生长曲线常用于测定细胞体外生长的趋势或药物等外来因素对细胞生长的影响。n一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮到贴壁，随后经历
15、潜伏期，再进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。n实验器材与试剂：n1、器材：细胞培养所需器材（同前）、细胞计数器、倒置显微镜、细胞计数板、微量加样器、塑料枪头等n2、试剂：完全培养基、无钙镁PBS、0.25%胰酶溶液、0.5%台盼蓝染液、药物n正常细胞生长曲线的测定：n1.胰酶消化细胞，用新鲜培养基中止，轻轻吹打，制成细胞悬液，计数。n2.根据计数结果，每个方瓶中接种细胞3105个，加3ml培养基，共接种7瓶（由于是学生实验，细胞用量较大，故每实验组不做重复计数，最后可用每班所计数的值求均数。也可接种9瓶细胞，计数9天）。n3.每间隔24h，共7天，分别计数每瓶细胞数。n4.计数时，用胰酶消化至镜下见细胞缩成圆形，用一定体积的原培养基中止消化，然后将细胞吹打成单细胞悬液，再用27ul细胞加入3ul台盼蓝染色液混合，显微镜下计数活细胞数，换算成单位体积的活细胞数（根据细胞生长的浓度，细胞悬液与台盼蓝染色液的比例可调整）。以每班计数的细胞数取平均数。n6.以细胞数（105/ml）为纵轴，以时间（h或 d）为横轴，绘制生长曲线图。n7.绘制实验结果。正常细胞生长曲线图 复习思考题：n细胞培养的过程中应注意哪些事项？
