1、2.2 2.2 动物细胞工程动物细胞工程生产单克隆抗体生产单克隆抗体等等 动物细胞工程常用的技术动物细胞工程常用的技术动物细胞培养动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞融合是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。一一.动物细胞培养动物细胞培养如何进行细胞培养如何进行细胞培养?2.2.12.2.1动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。长和增殖。(一一)概念概念问题问题
2、1 1：试说动物细胞培养大致过程、原理：试说动物细胞培养大致过程、原理(二二)动物细胞培养过程动物细胞培养过程 胚胎或幼龄动物的器官、组织胚胎或幼龄动物的器官、组织细胞悬液细胞悬液10-50代细胞代细胞剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理分瓶培养分瓶培养原代培养原代培养动物细胞培养动物细胞培养不能最终培养不能最终培养成生物体成生物体细胞增殖缓慢，核细胞增殖缓慢，核型可能变化型可能变化贴壁生长贴壁生长接触抑制接触抑制1010代以内，保持正常二倍体核型代以内，保持正常二倍体核型传代培养传代培养单个细胞单个细胞培养液培养液问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白
3、酶或胶原蛋白酶处理？问题问题2 2：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题3 3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出的营养容易供应，其代谢废物容易排出动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤
4、维等蛋白质，胰胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。问题问题5 5：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适，胰蛋白酶作用的适宜宜PH为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。问题问题6 6：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白
5、酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后,用用胰蛋胰蛋白酶白酶处理处理,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下来下来,然后加入然后加入新的培养液新的培养液,将细胞分离稀释将细胞分离稀释,并并从原培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称这个过程称传代培养传代培养.（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养原代培养原代培养定义：定义：人们通常将动物组织人们通常将动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代培养。称为原代培养。强调一：
6、原代培养与传代培养强调一：原代培养与传代培养细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限无限传代传代原代培养原代培养（一般）（一般）传代培养传代培养原代培养和传代培养、细胞株和细胞系（了解）原代培养和传代培养、细胞株和细胞系（了解）强调二：细胞贴壁过程强调二：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于帖附。于帖附。当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时,细胞就
7、会停止分裂增细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细胞的接触抑制。胞的接触抑制。强调三：接触抑制强调三：接触抑制 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？P46讨讨 论论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）元素等合成成
8、分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、适宜温度、PHPH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境(三三)动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件P46P461、无菌、无毒环境、无菌、无毒环境（无菌处理和添加抗生素目（无菌处理和添加抗生素目的？更换培养液的好处？）的？更换培养液的好处？）2、营养、营养:与体内相同，液体合成培养基：糖、氨与体内相同，液体合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素等，基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。通常需加入血清、血浆等一些天然成分。3、温度温度和和PH4、气体环境气体环境95%空气、空气、5%CO2-
9、维持培养液维持培养液PH适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为温度为36.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？养基有何独特之处？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等成分中有动物血清等P47P47最上面最上面1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。2
10、 2、培养的动物细胞作为基因工程的受体、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。细胞。3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。4 4、培养正常或各种病变的细胞，用于生、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为等，为 及其及其他疾病提供理论依据。他疾病提供理论依据。(四四)动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用筛选抗癌药物筛选抗癌药物治疗和预防癌症治疗和预防癌症植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全
11、能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白背诵背诵1、动物细胞培养的过程、注意问题、动物细胞培养的过程、注意问题2、动物细胞培养的条件、注意问题、动物细胞培养的条件、注意问题3、动物细胞培养和植物组织培养的、动物细胞培养和植物组织培养的比较比较相互接触相互接触接触抑制接触抑制单层单层胰蛋白酶胰蛋白酶衰老或死亡衰老
12、或死亡不死性不死性降低降低减少减少活细胞的膜具有活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。中中低温新陈代谢新陈代谢酶抗原抗原二二.动物细胞核移植技术和克隆动物动物细胞核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为终发育为动物个体（克隆动物）动物个体（克隆动物）分分类类胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复
13、全能性容易细胞分化程度低，恢复全能性容易 细胞分化程度高，恢复全能性不容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易(一一)、动物细胞核移植概念：动物细胞核移植概念：(二二)、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考：1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？胞作为受体细胞有什么好处？2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法
14、激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。现全能性的物质。(二二)、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：P49讨论：讨论：1.1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞
15、，在来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏(P49(P49小资料）。小资料）。培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至10105050代左代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而遗传物质可能会发生突变，而1010代以内的细胞代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基胞核移植中，为了
16、保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代础，通常采用传代1010代以内的细胞。代以内的细胞。2.2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了物，是对体细胞供体动物进行了100%100%的复制吗？的复制吗？为什么？为什么？绝大部分绝大部分DNADNA来自于供体细胞核，但其核外还有来自于供体细胞核，但其核外还有少量的少量的DNADNA，即线粒体中的，即线粒体中的DNADNA是来自于
17、受体卵是来自于受体卵母细胞。母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物不会是核供体动物100%100%的复制。的复制。(三三)、体细胞核移植技术的应用前景：、体细胞核移植技术的应用前景：1 1、在畜
18、牧业中、在畜牧业中可以加速家畜遗可以加速家畜遗传改良的进程传改良的进程2 2、保护濒危物种、保护濒危物种3 3、医药卫生领、医药卫生领域生产医用蛋白域生产医用蛋白质及组织器官的质及组织器官的移植移植4 4、了解胚胎发育和、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研衰老过程；追踪研究疾病的发展过程究疾病的发展过程和治疗疾病和治疗疾病 阅读课本阅读课本P50P50页页(四四)、体细胞核移植技术存在的问题：、体细胞核移植技术存在的问题：思考与探究思考与探究1.1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于的与分化程度高的组织细胞比较
19、，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？培养？思考一下，这是什么道理？提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。培养。思考与探究
20、思考与探究2.2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。其分化成所需要的组织或器官。3.199
21、73.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（名叫卢辛达（LucindaLucinda）的奶牛，年产奶量为）的奶牛，年产奶量为30.8 t30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3 34 t4 t。（1 1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶
22、量很高，有高产奶的遗传基可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖
23、，以避免奶牛尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2 2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再
24、将耳细成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。应用还有一定距离。
