1、精品课件结核分枝杆菌培养、药敏实验及质量控制2007-10-113酸性罗氏培养管上结核分枝杆菌菌落结核分枝杆菌显微镜下形态结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-116培养目的：一：增加分枝杆菌生产率，早期生长、早期诊断；二：提高阳性率，使少数细菌亦能生长出来；三：进一步进行药敏试验和菌型鉴定。2007-10-117培养培养 敏感性、特异性更强敏感性、特异性更强,理论上理论上10-10010-100条菌条菌/毫升可毫升可检出阳性；检出阳性；获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础 需时长需时长,根据接种量的大小，一般根据接种量的大小，一般2-82-8周才能得
2、到肉周才能得到肉眼可见菌落。眼可见菌落。需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备 相对涂片技术要求较高相对涂片技术要求较高 成本是直接涂片法的成本是直接涂片法的7-87-8倍。倍。据2001版伯杰金氏手册，结核杆菌现属于新成立的放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、分支杆菌科 结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（MTb）结核病的病原体结核病的病原体 18821882年郭霍（年郭霍（Robert KochRobert Koch）发现）发现 繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆菌菌 具有抗酸性具有抗酸性,又称抗酸杆
3、菌又称抗酸杆菌,用抗酸染色用抗酸染色的方法检查分枝杆菌的方法检查分枝杆菌 分枝杆菌有致病性和非致病性两大类分枝杆菌有致病性和非致病性两大类 主要引起肺結核主要引起肺結核的的致病性分枝杆菌有致病性分枝杆菌有人人型型牛牛型型非洲非洲田鼠分枝田鼠分枝杆杆菌菌 二、痰涂片镜检标准化操作二、痰涂片镜检标准化操作 结核杆菌（结核杆菌（MTb）形态）形态(杆菌型杆菌型)结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；运动能力；结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有时呈时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束、人字
4、形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。状或集聚成团。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。质组成。菌体内可有菌体内可有2-5个或更多的小圆形易染颗粒，异染个或更多的小圆形易染颗粒，异染颗粒可超过菌体横径。颗粒可超过菌体横径。显微镜下结核分支杆菌形态结核分枝杆菌显微镜下形态结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-1113结核分枝杆菌生长特性：结核分枝杆菌生长特性：缓慢：在一般培养基上分裂一代需要缓慢：在一般培养基上分裂一代需要1010多小时，多小时，一般一般10-3010-30天肉眼可见菌落生长。天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）
5、：粗糙、凸起、致密，菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。米色，不透明。2007-10-11142007-10-1115q 制备培养基制备培养基q 标本前处理（去污染）标本前处理（去污染）q 接种接种q 孵育孵育q 报告结果报告结果2007-10-1116 酸性罗氏酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基培养基 天门冬素天门冬素 3.6g 3.6g 或谷氨酸钠（纯度或谷氨酸钠（纯度99%99%以上）以上）7.2g7.2gKHKH2 2POPO4 4 14.0g 14.0gMgSO4
6、.7HMgSO4.7H2 2O 0.24gO 0.24g枸橼酸镁枸橼酸镁 0.6g0.6g丙三醇丙三醇 12ml12ml蒸馏水蒸馏水 600ml600ml新鲜鸡卵液新鲜鸡卵液 1000ml1000ml2%2%孔雀绿孔雀绿 20ml20ml一、一、培培 养养 基基2007-10-1118原理：原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：原则：-尽可能杀灭标本中的杂菌尽可能杀灭标本中的杂菌 -尽可能保存标本中的分枝杆菌尽可能保存标本中的分枝杆菌二、标本前处理二、标本前处理2007-10-
7、1119 操作操作 振荡匀化振荡匀化静置静置15分钟分钟2007-10-1120 37 37竖直培养竖直培养8 8周周均匀接种均匀接种0.1ml,2支支/标本标本斜面向上，斜面向上，3737水平放置水平放置24小时小时三、接种和孵育三、接种和孵育2007-10-1121 接种后第接种后第3 3、7 7天各观察一次菌落生长情天各观察一次菌落生长情况况 此后每周观察一次，直至满此后每周观察一次，直至满8 8周周 记录菌落生长及污染情况。记录菌落生长及污染情况。四、结果的观察与报告四、结果的观察与报告2007-10-1122报报 告告 方方 式式分枝杆菌培养阴性：分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长斜面
8、无菌落生长菌落生长不足斜面面积菌落生长不足斜面面积1/41/4者，报实际菌落数。者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（1+1+）：菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的1/41/4分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（2+2+）：菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的1/21/2分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（3+3+）：菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的3/43/4分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（4+4+）：菌落生长布满整个斜面菌落生长布满整个斜面2007-10-1123 分离培养流程分离培养流程:涡旋振荡涡旋振荡2-32-3次次痰标本中加入痰标本中加入1-21-2倍
9、体积倍体积4%NaOH4%NaOH分别接种分别接种0.1ml0.1ml前处理液至前处理液至2 2只培养基斜面只培养基斜面接种后接种后3 3天、天、7 7天天观察，此后每周观察，此后每周观察一次观察一次置置3737o oC C温温箱培养箱培养有菌落生长需经有菌落生长需经抗酸染色确认，抗酸染色确认，至第至第8 8周无菌落周无菌落生长报告阴性生长报告阴性室温静置室温静置1515分钟分钟4 43 32 25 56 67 71 12007-10-1124可能原因可能原因解决方法解决方法标本保存不当标本保存不当(时间、时间、温度）温度）涂片后标本于冰箱保存，涂片后标本于冰箱保存，2424小时内培养。小时内
10、培养。标本选择不当标本选择不当选择标本中脓样、干酪样选择标本中脓样、干酪样可疑部分可疑部分过处理（时间、浓度过处理（时间、浓度)4 4NaOHNaOH，1 12 2倍体积，倍体积，2020分钟分钟接种量太小接种量太小每管接种每管接种0.10.1毫升毫升温箱温度不当温箱温度不当温箱内置温度计，每日监温箱内置温度计，每日监测温度。测温度。涂阳培阴率过高？涂阳培阴率过高？2007-10-1125可能原因可能原因解决方法解决方法标本保存不当标本保存不当(时间、温度）时间、温度）涂片留取后涂片留取后2424小时内培养，不能及时小时内培养，不能及时培养的培养的4 4o oC C冰箱保存。冰箱保存。前处理不
11、充分前处理不充分4 4，1 12 2倍，充分混旋，倍，充分混旋，2020分钟。分钟。材料灭菌不佳材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。接种用吸管需高压灭菌。操作不当操作不当培训，严格按操作规程操作。培训，严格按操作规程操作。培养基因素培养基因素统一供应，统一供应，4 4o oC C直立保存，直立保存，1 1个月内使个月内使用用污染率过高？污染率过高？2007-10-1126菌种保存原则：一个有利的休眠环境，干燥、低温、缺氧、缺乏营养和添加保护剂等。一：长期保存 1ml 分枝杆菌菌液经离心沉淀后，去上清，将沉淀悬浮于1ml 7H-9OADC-0.5%TWEEN80-50%丙三醇中，-70oC保存。O
12、ADC:0.5%BSA、0.2%葡萄糖、0.06%油酸、140mmol/LNaCl和0.05%Tween802007-10-1127二：短期保存 1.1ml分枝杆菌菌液-70oC保存；2.罗氏培养基上菌落加无菌液体石蜡后，4oC保存。结核分枝杆菌培养质量控制结核分枝杆菌培养质量控制 目前缺少标准的分离培养质量评价方目前缺少标准的分离培养质量评价方法！法！结核分枝杆菌培养的实验室系统结核分枝杆菌培养的实验室系统 1.1.建立标准化的培养实验室建立标准化的培养实验室 2.2.快速快速/安全的标本运输工作系统安全的标本运输工作系统 3.3.便于患者标本集中培养便于患者标本集中培养 4.4.安全可靠的
13、实验室配套设备和材料安全可靠的实验室配套设备和材料 5.5.工作人员培训工作人员培训分离培养实验室的基本要求分离培养实验室的基本要求 房间及设施：一个独立房间、有上下水及电的供应、房间及设施：一个独立房间、有上下水及电的供应、通风和照明良好通风和照明良好 仪器：培养箱、冰箱（仪器：培养箱、冰箱（44）、蒸汽凝固灭菌器（若）、蒸汽凝固灭菌器（若自制培养基）、涡旋振荡器、定时器、酒精灯自制培养基）、涡旋振荡器、定时器、酒精灯 耗材：痰盒、培养管及架移液、管废液（物）缸耗材：痰盒、培养管及架移液、管废液（物）缸 试剂试剂:氢氧化钠、蒸馏水、磷酸二氢钾、硫酸氢氧化钠、蒸馏水、磷酸二氢钾、硫酸镁镁7H2
14、O7H2O、柠檬酸镁、谷氨酸钠、孔雀绿、鲜鸡蛋、柠檬酸镁、谷氨酸钠、孔雀绿、鲜鸡蛋（若自制培养基）（若自制培养基）生物安全：生物安全：型生物安全柜、高压灭菌锅、紫外灯、型生物安全柜、高压灭菌锅、紫外灯、消毒剂、工作服、口罩、帽、手套消毒剂、工作服、口罩、帽、手套 按照高致病性病原微生物的要求进行检测按照高致病性病原微生物的要求进行检测；实验室应实验室应为为P2P2或或P2P2以上以上级级别的别的实验室，实验室，应有应有二级二级生物安全柜生物安全柜；标准化的操作流程标准化的操作流程；良好的个人防护措施以及定期对操作人员进良好的个人防护措施以及定期对操作人员进行体检并进行生物安全培训行体检并进行生
15、物安全培训；实验室应有完善的规章制度和应急预案等。实验室应有完善的规章制度和应急预案等。分离培养实验室生物安全基本要求分离培养实验室生物安全基本要求如何获得合格标本如何获得合格标本 标本采集：标本采集：痰液应来自患者肺部。痰标本应以脓痰、血痰液应来自患者肺部。痰标本应以脓痰、血痰、干酪痰或粘液痰为合格痰标本，唾液和痰、干酪痰或粘液痰为合格痰标本，唾液和口水为不合格标本。口水为不合格标本。按照标本采集时间分为即时痰、夜间痰、晨按照标本采集时间分为即时痰、夜间痰、晨痰。痰。肺结核病人结核杆菌检出率与痰标本采集的肺结核病人结核杆菌检出率与痰标本采集的好坏有直接关系。医生或检验人员应告诉初好坏有直接关
16、系。医生或检验人员应告诉初诊病人留取合格痰标本的方法。诊病人留取合格痰标本的方法。如何获得合格标本如何获得合格标本标本保藏和运送：标本保藏和运送：在运送可感染人类的高致病性病原微生物菌在运送可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照（毒）种或样本时，须按照可感染人类的可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定管理规定的要求进行审批、包装、运输、的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理。操作、保藏和管理。采集后立即送检，当天不能检查的痰标本置采集后立即送检，当天不能检查的痰标本置4C4C冰箱保存。冰箱保存。外送标本要认真核对
17、痰盒和外送标本要认真核对痰盒和化验单上姓名、序号等项目，化验单上姓名、序号等项目，7 7天内必须进天内必须进行培养。行培养。结核菌培养及药敏标本采集送检须知培养一些指标培养一些指标 污染率污染率:3-5%3-5%(固体培养固体培养);5-10%;5-10%(液体培养液体培养)阳性结果需要的平均时间阳性结果需要的平均时间 :4-5:4-5 周周 涂阴培阳率涂阴培阳率:10%10%影响因素：1.培养基质量2.NaOH的量3.消化时间4.离心力5.离心时间6.接种量7.培养箱的温度分枝杆菌药敏试验分枝杆菌药敏试验 我国是高耐药国家我国是高耐药国家 2010年第五次流行病调查年第五次流行病调查 总耐药
18、：总耐药：37.79%初治：初治：35.16%复治：复治：55.17%MDR:8.36%XDR:0.6%耐药性检测目的耐药性检测目的 指导用药指导用药 化疗前药敏化疗前药敏选择用药选择用药 疗效不佳时药敏疗效不佳时药敏观察有无耐药性、观察有无耐药性、调整用药调整用药监测社会中耐药结核菌株的流行情况监测社会中耐药结核菌株的流行情况评价和改进国家结核病控制措施的重要评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一。参考因素之一。耐药性检测指针耐药性检测指针 初治结核病人观察起始耐药菌感染初治结核病人观察起始耐药菌感染 复发结核病人复发结核病人 痰菌阴转后复阳的病人痰菌阴转后复阳的病人 化疗化疗36个
19、月痰菌持续阳性者个月痰菌持续阳性者 痰菌减少后又持续增加者痰菌减少后又持续增加者 非结核分枝杆菌感染者非结核分枝杆菌感染者 结核病流行病学调查结核病流行病学调查耐药性测定常用方法耐药性测定常用方法 绝对浓度法绝对浓度法:是我国是我国30 多年来一直沿用的药敏多年来一直沿用的药敏试验方法，试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法常规使用的用于临床检测的方法。比例法比例法:是是WHO 全球耐药监测项目中推荐的全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法，标准药敏试验方法，目前为我国流行病学监测目前为我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采
20、用的方法。和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法。二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差别。等方面都有一定差别。比例法比例法 该法是该法是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法。药敏试验方法。它是二它是二种浓度的细菌种浓度的细菌接种在一种接种在一种浓度的含药培养基上，浓度的含药培养基上，以计算耐药百分比以计算耐药百分比:含药培养基上生长的菌落数含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上菌对照培养基上菌落数落数*100%，若耐药百分比大于，若耐药百分比大于1%，则认为受试，则认为受试菌对该抗结核药耐药。菌
21、对该抗结核药耐药。比例法比例法 比例法药敏试验药物终浓度比例法药敏试验药物终浓度 药物药物 L-J培养基中最终药物（培养基中最终药物（ug/ml）INH （异烟肼）（异烟肼）0.2 SM（链霉素）（链霉素）4.0 EMB （乙胺丁醇）（乙胺丁醇）2.0 RFP （利福平）（利福平）40.0 OFX（氧氟沙星）（氧氟沙星）2.0 K（卡那霉素）（卡那霉素）30.0 AK（阿米卡星）（阿米卡星）30.0 CPM（卷曲霉素）（卷曲霉素）40.0 药敏试验准备比例法比例法 菌液制备和菌液制备和稀释稀释 用接种环刮取生长旺盛的菌落（注意不要取个用接种环刮取生长旺盛的菌落（注意不要取个别菌落，要广泛取样）
22、置于加有少许别菌落，要广泛取样）置于加有少许PB缓冲液缓冲液的磨菌管底部，充分研磨，使呈乳酪样均匀菌液，的磨菌管底部，充分研磨，使呈乳酪样均匀菌液，用比浊管比浊配成用比浊管比浊配成1mg/ml菌液。菌液。用刻度吸管或用刻度吸管或2222号标准接种环沾取号标准接种环沾取2 2满环满环mg/mlmg/ml的菌液，移至的菌液，移至2 ml2 ml灭菌生理盐水中，即稀释灭菌生理盐水中，即稀释成成1010-2-2mg/mlmg/ml菌液；用同样方法再进行菌液；用同样方法再进行100100倍稀释，倍稀释，即成即成1010-4-4mg/mlmg/ml菌液。菌液。（注：（注：2222号标准接种环：金属丝直径号
23、标准接种环：金属丝直径0.7mm,0.7mm,接种环接种环内径内径3mm3mm，满环移液，满环移液0.01ml0.01ml）。）。比例法比例法 接种和培养接种和培养 用用22 号标准接种环分别沾取号标准接种环分别沾取1环环（即（即0.01ml）10-2mg/ml和和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和和10-6mg。接种后的培养基置于接种后的培养基置于37培养，至培养，至4周后报告结周后报告结果。
24、果。比例法比例法 结果报告结果报告 记录并报告菌落生长情况记录并报告菌落生长情况 融合成片（融合成片（500个菌落）个菌落）4+大部分融合（大部分融合（200500个菌落）个菌落）3+100200个菌落个菌落 2+50100个菌落个菌落 1+50个菌落个菌落 报告菌落实数报告菌落实数比例法比例法 结果报告及解释结果报告及解释计算耐药百分比计算耐药百分比:耐药百分比耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数含药培养基上生长的菌落数/对照培养对照培养基上菌落数基上菌落数*100%若耐药百分比大于若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药，则认为受试菌对该抗结核药耐药。耐药。国家参比实验室负责对各省参比实验室的国家参比实验室负责对各省参比实验室的熟练度测试，每年一次。熟练度测试，每年一次。每套熟练度测试的菌株的不少于每套熟练度测试的菌株的不少于30管培养管培养物。测试菌中应包括不同耐药谱的菌株和物。测试菌中应包括不同耐药谱的菌株和一定数量的敏感菌株。一定数量的敏感菌株。
