1、课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段DNA指纹法在案件侦破中有重指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取场的血液、头发等样品中提取的的DNA，与犯罪嫌疑人的，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。件的侦破提供证据。讨论：讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的员要怎样才能得到足够量的DNA呢？呢？2.你还能说出你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？鉴定技术在其他
2、方面的应用吗？ATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 识别识别：-OH端为端为3;磷酸基团的磷酸基团的末端为末端为5。解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3 3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸 思考：思考：体外扩增体外扩增DNADNA时，如何提供与体时，如何提供与体内内DNA复制相似条件？复制相似条件？变性变性（80100）Taq DNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）2030个核苷酸构
3、个核苷酸构成成DNA或或RNADNA双链双链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）DNA单链单链变性的目的：变性的目的：解开双链解开双链复性的目的：复性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2与两条单链与两条单链的结合的结合PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调自动调控温度控温度的仪器，它可以根据的仪器，它可以根据DNA的热变的热变性原理性原理，通过自动改变温度，达到扩增，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸适温延伸高温变性高温变性低温复性低温复性重复重
4、复1 13 3步步3030轮轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸变性变性 复性（退火）复性（退火）延伸延伸二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 三、三、PCR实验操作实验操作一种通过高速转动产生离心现象，能将一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。固体与液体分开的设备。（1）按
5、配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）四、四、结果分析与评价结果分析与评价DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释 对照调零对照调零 测定测定 计算计算5050倍倍蒸馏水做蒸馏
6、水做对照对照波长波长260nm处读数处读数 测定并测定并 的含量为的含量为紫外分光光度计紫外分光光度计比色杯比色杯体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解
7、旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 3 3端延伸端延伸课堂小结课堂小结多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数
8、设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算练习巩固：练习巩固：1.做做PCRPCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是使用前必须进行的关键步骤是 A.A.反复洗涤反复洗涤 B.B.不怕外源不怕外源DNADNA污染污染 C.C.高压灭菌高压灭菌 D.D.在在-20-20储存储存2.PCR2.PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是 A.A.原理简单原理简单 B.B.原料易获得原料易获得 C.C.Taq DNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性 D.D.快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作
