1、第五模块第五模块 生物检测技术生物检测技术第九章第九章 药品的生物检定法药品的生物检定法知识目标知识目标 理解热原检查法、细菌内毒素检查法的含义；掌握无菌检查法、微生物限度检查的主要方法；理解药物异常毒性检查的方法技能目标技能目标 能检查药物制剂的热原、细菌内毒素；能进行药物的无菌检查；能测定药物的微生物限度；能检查药物的异常毒性学习目标学习目标复习提问复习提问 1什么是管碟法？管碟法操作的主要流程？2双碟的制备方法？新课大纲新课大纲本节主要内容：本节主要内容：热原检查热原检查:1.简述简述 2.具体操作方法具体操作方法内毒素检查内毒素检查:1.简述简述 2.具体操作步骤具体操作步骤 一、概一
2、、概 述述 用整体动物的体内试验或离休用整体动物的体内试验或离休器官、组织、细胞等的体外试验来测定器官、组织、细胞等的体外试验来测定药品生物活性，以反映其临床功能及效药品生物活性，以反映其临床功能及效价的一种方法。价的一种方法。1.生物检定法生物检定法常见药物常见药物的生物检的生物检定法定法肝素肝素绒促性素绒促性素缩宫素缩宫素胰岛素胰岛素洋地黄洋地黄二、热原检查法二、热原检查法含热原的注射液注入家兔体内，引起体温升高40度以上，甚至出现昏迷、休克、死亡的现象。2.什么是热原反应？3.热原的基本性质？热原的基本性质？水溶性、不挥发性、耐热性、滤过性4.污染途径污染途径溶剂带入原料带入容器用具带入
3、制备过程污染灭菌不完全使用带入5.除去方法吸附法、离子交换法、吸附法、离子交换法、反渗透法、超滤、高温、反渗透法、超滤、高温、酸碱酸碱6.检查方法检查方法家兔致热实验法7.具体具体步骤步骤静脉注入药物，观察家兔体温升高情况，超过限度认为有热原反应供试用家兔供试用家兔试验前的准备试验前的准备检查法检查法结果判断结果判断3只兔：1小时测1次，共3次，最高-最低升高的温度结果：均升高在0.6度以下且升高的总数在1.4以下认为符合规定智能热原仪智能热原仪温度探头温度探头 本法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素（单位以EU表示），以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4、细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法。三、细菌内毒素检查法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或 半定量内毒素的方法。分为浊度法和显色基质法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。可分为终点浊度法和动态浊度法。显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。可分为终点显色法和动态显色法。凝胶法凝胶法光度测定法光度测定法内毒素与鲎试剂起反应产生凝胶，观察到浑浊。什么是鲎试什么是鲎试剂剂？什么是细菌内毒素？1.凝胶法原理来源：G-细胞壁外膜上细胞壁外膜上的脂多糖的脂多糖（LPS）成分
5、，所以内毒素是化学成分不是简单的生命体，所以灭内毒素时应与其他成分区分。什么是细菌内毒素？什么是细菌内毒素？化学结构：a b c a(o特异性多糖链)类似于抗原，亲水性 b 核心多糖 c类脂类脂A，疏水性，是生理活性中心，疏水性，是生理活性中心，实验证明，将a 和 b 切下来组合后与 c部分产生的效果相当，所以认为c是生理活性部位。特点：根据其特殊结构，疏水基团易粘合在容器的器壁，而在水中的浓度就变低，另一方面疏水端相连结后，亲水端再与别的疏水端相连而成大的集团，使其在水中的分布不均匀，所以药典规定在使用时要经过振荡及混振荡及混旋旋15分钟分钟，并立即做下一步操作，但这种现象只限于人工提纯品。
6、与热原的关系：广义热原包括内毒素、生物酶、蛋白质、化学物质（后三种成分也有致热作用，但不引起器质性的病变），而狭义的热原就等于内狭义的热原就等于内毒素毒素（引起器质性的病变）。所以药品检测时一般认为没有内毒素，合格时，热原检测也合格。分类：分国家标准品：（简写RSE或NSE）效价：9000，单位Eu,由中检所生产，代号981就是指98年1月生产。和工作标准品：（CSE和WSE）效价：100200，也有50或70，单位Eu，到中检所购买，是法定试剂。拉丁文TAL（东方鲎）、LAL（美洲鲎），血液是蓝色（还有蝉）。被称为是活化石，大约生活在4亿年前至今，体态基本没有变化，品种有10多种，但能作为鲎
7、试剂（血液变形细胞溶解鲎试剂（血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品）物的无菌冷冻干燥品）用的只有35个，主要生活在日本沿海、中国沿海、北美沿海，在中国是二级保护动物，在日本是特级保护动物。不能人工养殖。什什么么是是鲎鲎试试剂剂？发现：1962年，美国的一个研究员Bang在海滩散步，发现很多鲎（也叫大王蟹）死了，他拿针管吸了海水，注入一个活鲎体内，发现其很快死亡，1963年写了一篇“鲎的一种致死疾病”文章，向研究所反应，争取一些经费以此为主要研究方向，他的助手年轻人levin和他一起研究，发现G-细胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分引起鲎致死，共同发表文章“鲎的酶反应机理”。反应机理：鲎试剂中含有C
8、、B因子，在脂多糖存在时成为激活因子，使凝血酶原变为凝血酶，又使凝固蛋白原变为凝固蛋白（成凝胶状），发生这样的生化反应。而口服与输入血液的剂量相比100万倍，所以人口服内毒素不会发生发热反应，另一方面口服时人体也有一种屏障作用。日本认为血中0.1Eu/ml,就会有发热反应。凝胶法的灵敏度低：0.5 Eu/ml，规格：0.1 ml 定量法高，0.06Eu/ml，工艺在凝胶法基础上发展而来，0.6 ml，也有1.2和3.1 ml。检测方法区别：内毒素小于0.03 Eu/ml的无菌注射用水，鲎试剂反应的PH：68，而工业生产要求为PH：57，所以不能以企业生产不能以企业生产的灭菌注射用水来作为检的灭
9、菌注射用水来作为检查用水查用水，必须是中检所指定生产。药典规定凝胶法小于0.03 Eu/ml，定量法小于0.005 Eu/ml，买时要配套，与鲎试剂买一个厂家生产的。关于检查用水关于检查用水内毒素检查法内毒素鲎试剂检查用水 2.定量分析方法定量分析方法预设限值法：预设限值法：OD为为0.02什么是OD?OD：就是就是吸光度吸光度，仪器采用透仪器采用透光率下降到光率下降到95%的点作为的点作为反应时间临界点，将反应时间临界点，将95%取负对数正好是取负对数正好是0.02 3.实验前期工作实验前期工作器材准备器材准备所需试剂所需试剂 用具的处理用具的处理稀释内毒素标准品稀释内毒素标准品制备鲎试剂制
10、备鲎试剂制备标准曲线制备标准曲线生成标准曲线生成标准曲线4.具体操作 示例 头孢曲松钠注射液内毒素测定头孢曲松钠注射液内毒素测定稀释内毒素标准品稀释内毒素标准品 0.2ml 0.2 0.2 0.2 1.8ml水水 1.8 1.8 1.8100Eu/ml 10 1 0.1 0.01 制备鲎试剂制备鲎试剂 制备标准曲线制备标准曲线10支小管分加0.1ml鲎试剂鲎试剂2个个管阴管阴性加性加水水8个管加内个管加内毒素标准品毒素标准品 生成标准曲线生成标准曲线 待最后一个浓度点的反应曲线待最后一个浓度点的反应曲线超过超过0.02限值后，用鼠标点中限值后，用鼠标点中“手动停止检测手动停止检测”点击点击“生成标准曲线生成标准曲线”样品稀释与加样 样品四个浓度稀释样品四个浓度稀释8个阳性管个阳性管（如：（如：40.80.160.320）平行平行2个，共个，共8个管个管每个管加每个管加0.1鲎试剂鲎试剂阳性对照阳性对照：找出最佳稀释倍数：找出最佳稀释倍数算出头孢曲松钠内毒素浓度算出头孢曲松钠内毒素浓度 为为 0.065Eu/mg,小于限值小于限值0.2Eu/mg。结结果果分分析析阴性对照：阴性对照：反应时间远小于标准曲线0.01所用反应时间，阴性合格 本课小结本课小结课后习题课后习题 家兔热原检查法如何操作？浊度法检测细菌内 毒素的具体操作步骤？
