1、环境工程微生物学实验实验六：细菌的简单染色与革兰氏染色适用范围：环境工程专业适用范围：环境工程专业实验教师：李宁实验教师：李宁 顾彦顾彦一、目的一、目的（1）了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中的重要性。（2）学会细菌染色的基本技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。二、染色原理二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物
2、细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。(一一)简单染色法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。三、染色方法三、染色方法(二二)复复染色法染色法 用两种或多种染料染细菌，目
3、的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性革兰氏染色法和抗酸性染色法。染色法。革兰氏染色法：革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的细胞壁的成分和结构成分和结构不同而造成的。三、染色方法三、染色方法三、染色方法三、染色方法四四、实验器材、试剂、材料、实验器材、试剂、材料1.材料：材料：枯草杆菌、大肠杆菌。2.器材：器材：废液缸、洗瓶、载玻片、
4、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜3.试剂：试剂：草酸铵结晶紫染液 革兰氏碘液 体积分数为95%酒精 质量浓度为5g/L蕃红（沙黄）染色液1涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种少量菌种(玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大涂布面不宜过大。2干燥（固定）干燥（固定）室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，放置待冷后，进
5、行染色。切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。标本烤枯而变形。五、实验内容与步骤五、实验内容与步骤(一一)细菌的简单染色细菌的简单染色 涂片涂片干燥（固定）干燥（固定）染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检3染色染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。4水洗水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈洗下的水呈无色为止无色为止。5干燥干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥或微热烘干。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。切勿将菌体擦掉。6镜检镜检 先低倍观察，再高倍观察
6、，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。(一一)细菌的简单染色细菌的简单染色 涂片涂片干燥干燥（固定）（固定）染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检(二二)细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色步骤步骤 涂片涂片干燥干燥固定固定初染初染水洗水洗媒染媒染水洗水洗脱色脱色水水洗洗复染复染水洗水洗干燥干燥观察观察五、实验内容与步骤五、实验内容与步骤1.涂片、固定涂片、固定染色约1min同简单染色法。2.初染初染滴加草酸铵结晶紫染色液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2min，水洗。3.媒染媒染滴加革兰氏碘液，染色约1-2min，水洗。(二二)细菌的
7、革兰氏染色细菌的革兰氏染色步骤步骤 涂片涂片干燥干燥固定固定初染初染水洗水洗媒染媒染水洗水洗脱色脱色水水洗洗复染复染水洗水洗干燥干燥观察观察4.脱色脱色滴加体积分数为95%乙醇，约20-30S后即水洗，至流出的乙醇不现紫色为止；或滴加体积分数为95%乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2-3次后即水洗。5.复染复染滴加沙黄染液（番红）1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约2-3min，水洗并使之干燥。6.镜检镜检同简单染色，并根据呈现的颜色判断该菌属是G+细菌还是G-细菌，紫色紫色的是革兰氏阳性菌，红色红色的是革兰氏阴性菌。革兰氏染色紫色紫色的是革兰氏阳性菌，的是革兰氏阳性菌，红色红色的是革兰
8、氏阴性菌。的是革兰氏阴性菌。六、注意事项1革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，G-细菌培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。1 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？2 通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？七、思考题
