1、Bac-to-BacBac-to-Bac杆状病毒杆状病毒表达载体系统表达载体系统生产重生产重组蛋白组蛋白蛋白组蛋白组吴召慧吴召慧211-5-10211-5-10主要内容主要内容：v1.1.杆状病毒表达载体系统杆状病毒表达载体系统简介简介v2.2.基本原理基本原理v3.3.主要操作流程主要操作流程1 1：杆状病毒表达载体系统：杆状病毒表达载体系统简介简介v杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状）是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一病毒作
2、载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统个重组蛋白生产系统。v 杆状病毒表达载体系统的建立和发展杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为被誉为20 世纪世纪80 年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因工程四大表达系统工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统动物细胞表达系统)之一之一。v杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒体病毒（Autographa californica multiple nu
3、clear polyhedrosis virus，AcMNPV）表达系统和家蚕核型多）表达系统和家蚕核型多角体病毒（角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus,BmNPV）表达系统。）表达系统。v杆状病毒科分为包含体病毒亚科（杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和）和非包含体病毒亚科（非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒），包含体病毒亚科分为核型多角体病毒属（亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属）和颗粒体病毒属（GV）杆状病毒表达系统的优缺点杆状病毒表达系统的优缺点优点优点v 对外
4、源基因容量大对外源基因容量大 v 适合表达细胞毒性蛋白适合表达细胞毒性蛋白v 安全性且表达产量高安全性且表达产量高 v 后加工过程完全后加工过程完全v 可以同时表达多个外源基因可以同时表达多个外源基因 v 体内表达体内表达 缺点缺点v瞬时表达瞬时表达 v糖基化简单糖基化简单2 2：基本原理：基本原理v1 1：目的基因插入转移载体。：目的基因插入转移载体。v2 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯化获得重组病毒。化获得重组病毒。v3 3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。v4 4：纯化目的蛋白：纯化目的蛋白杆状病毒表达
5、载体的构建杆状病毒表达载体的构建v转移载体转移载体 通常由三部分组成：通常由三部分组成：vE.coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保），保证转移载体能在大肠杆菌中扩增。证转移载体能在大肠杆菌中扩增。v含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下插入要表达的外源基因。插入要表达的外源基因。v启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列，用于与野生病毒序列，用于与野生病毒DNA同源重组。同源重组。直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋
6、白比较困直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难，为纯化常采用下列方法：难，为纯化常采用下列方法：(1)(1)在外源基因的前端插入在外源基因的前端插入6 6HisHis，表达的融合蛋白可通过，表达的融合蛋白可通过NiNi柱进行亲和层析纯化。柱进行亲和层析纯化。(2)(2)将谷胱甘肽转移酶基因（将谷胱甘肽转移酶基因（GSTGST）导入外源基因前端，利用）导入外源基因前端，利用GSTGST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。(3)(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素具有非常高的结合能力
7、，可以对表达产物进行纯化。具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。BacBactotoBacBac系统重组病毒的构建和基因的表达系统重组病毒的构建和基因的表达3：主要操作流程：主要操作流程DH10Bactem.coliDH10Bactem.coli感受感受态细态细胞的制胞的制备备转化转化DH10Bactem.coliDH10Bactem.coli提取重组病毒提取重组病毒Sf9Sf9细细胞胞转转染，染，复制重组病毒复制重组病毒生产重组蛋白生产重组蛋白DH10Bactem.coli感受态细胞的制备感受态细胞的制备v1.1.取取3mlLB3mlLB液体培养基至液体培养基至15ml15ml无菌离
8、心管，加入无菌离心管，加入3l 3l 50mg/ml50mg/ml卡那霉素（卡那霉素（kankan）和）和6l l5mg/ml6l l5mg/ml四环素四环素(tet)(tet)混匀；混匀；v2.2.接种接种DH10BACTME.coliDH10BACTME.coli菌种至上述菌种至上述LBLB培养基中，培养基中，37,200rpm37,200rpm培养培养14-16h14-16h；v3.3.按按1:1001:100取取1ml1ml过夜培养的过夜培养的DH10BACTME.coliDH10BACTME.coli菌液至菌液至100ml 100ml 新鲜新鲜LBLB液体培养基液体培养基【加加100
9、l kan100l kan（50mg/ml50mg/ml）和）和200l 200l tet tet（5mg/ml5mg/ml四环素）四环素）】，37,220rpm37,220rpm，约，约2h2h，至，至OD=0.4-OD=0.4-0.60.6；v4.4.上述细菌液转移至上述细菌液转移至50ml50ml无菌离心管无菌离心管,冰浴冰浴20min20min，每，每5min5min摇摇动一次，同时冰浴上动一次，同时冰浴上0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%甘油；甘油；v5.5.细菌液细菌液44，4500rpm4500rpm，离心，离
10、心5min5min，弃上清；，弃上清；v6.6.加加10ml 0.1M MgSO410ml 0.1M MgSO4重悬菌体，冰浴重悬菌体，冰浴20min20min；v7 744，4500rpm4500rpm，离心，离心5min5min，弃上清；，弃上清；v8.8.加加10ml 0.1M CaCl2+15%10ml 0.1M CaCl2+15%甘油，重悬；甘油，重悬；v9.200l9.200l每管分装至每管分装至1.5ml tube1.5ml tube管（管（-80-80预冷），预冷），-80-80保保存。存。转化转化DH10BACTME.coliv1.1.冰上融化冰上融化DH10BACTM E.
11、coliDH10BACTM E.coli感受态细胞（约感受态细胞（约5min5min）；）；v2.2.取取1ng pFastbac-1ng pFastbac-重组质粒至重组质粒至DH10BACTM E.coliDH10BACTM E.coli感受态感受态细胞轻弹两下混匀，冰上静置细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min30min；v3.423.42热击热击4545秒；立即转移至冰上冰浴秒；立即转移至冰上冰浴2min2min；v4.4.加加800l800l室温预热的室温预热的LBLB培养基，培养基，37,220rpm37,220rpm，4h4h；v5.5.涂布至涂布至LBLB琼脂平板（含琼脂平板（含
12、Kan,Tet,GenKan,Tet,Gen）,v6.6.挑取白色菌落接种至挑取白色菌落接种至5mLLB5mLLB液体培养基（抗生素如上），液体培养基（抗生素如上），3737培养过夜。培养过夜。v7.7.保种，提重组质粒保种，提重组质粒重组病毒的提取重组病毒的提取(试剂盒）试剂盒）v1 1 用用1.5 ml1.5 ml离心管收集离心管收集1-5 ml1-5 ml菌液。菌液。12,000 rpm12,000 rpm离心离心1min1min，弃上清。弃上清。v2 2 加入加入250 l250 l溶液溶液/RNase A/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮
13、。室温静置菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min1-2min。v3 3 加入加入250 l250 l溶液溶液，轻柔地反复颠倒混匀，轻柔地反复颠倒混匀5-65-6次。室温放次。室温放置置1-2 min1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。v4 4 加入加入300 l300 l溶液溶液，立即轻柔地反复颠倒混匀，立即轻柔地反复颠倒混匀5-65-6次。此次。此时会出现白色絮状沉淀时会出现白色絮状沉淀。v5 12,000 rpm 5 12,000 rpm 室温离心室温离心15min15min，收集上清。，收集上清。v6 6 加入加入800ul8
14、00ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。异丙醇，混匀至有沉淀出现。v7 12,000 rpm 7 12,000 rpm 室温，离心室温，离心15 min15 min，弃上清。，弃上清。v8 8 加入加入800ul buffer w2800ul buffer w2洗涤洗涤,12,000 rpm,12,000 rpm 室温离心室温离心1min1min，弃滤液。重复洗涤一次。弃滤液。重复洗涤一次。v9 9 室温或风干室温或风干DNADNA，加入，加入50-80ulEluent50-80ulEluent溶液，冰上溶解溶液，冰上溶解10min 10min，44保存。保存。Sf9细胞转染细胞转染v1 13737
15、预热预热Sf900TM-III SFMSf900TM-III SFM培养基；培养基；v2.2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a a溶解溶解5l5l纯化的杆状病毒重组质粒于纯化的杆状病毒重组质粒于100l Sf900TM-100l Sf900TM-III SFMIII SFM培养基；培养基；b b转染试剂充分摇匀后取转染试剂充分摇匀后取8l8l加入加入100l Sf900TM-III 100l Sf900TM-III SFMSFM培养基，混匀；培养基，混匀；c c将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温
16、孵育20min20min；v3 3Sf9Sf9细胞计数细胞计数,取取6 6孔板，每孔加入孔板，每孔加入1.61.6106106个细个细胞胞(其中一孔设为空白对照其中一孔设为空白对照)，补加预热的，补加预热的Sf900TM-Sf900TM-III SFMIII SFM培养基至培养基至2ml2ml，混匀，室温静置，混匀，室温静置15min15min，使细，使细胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度，胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度，观察是否符合需求量）观察是否符合需求量）v4 4重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒名称；名称；v5
17、52727湿盒孵育，直到病变现象产生。湿盒孵育，直到病变现象产生。v6.6.离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysis lysis buffer buffer 做做Western-blot Western-blot 检测是否有目的蛋白。检测是否有目的蛋白。生产重组蛋白生产重组蛋白v1.1.将转染过程收集的病毒加入将转染过程收集的病毒加入sf9sf9细胞；细胞；v按以下公式计算所需病毒体积：按以下公式计算所需病毒体积：Inoculum required(ml)=MOI(pfu/cell)Inoculum required(ml)=MOI(pfu/cell)
18、number number of cells/titer of viral stock(pfu/ml)of cells/titer of viral stock(pfu/ml)v2.2.收集细胞液，收集细胞液，600rpm600rpm，离心，离心5min5min，上清避光保存，细，上清避光保存，细胞沉淀加胞沉淀加Lysis bufferLysis buffer重悬；重悬；v3.3.超声破碎：超声破碎：200HZ200HZ，破碎，破碎15s15s，间歇，间歇30s,330s,3个循环；个循环；v4.4.离心：离心：44，15000rpm15000rpm，30min30min，0.45m0.45m过滤器过滤上过滤器过滤上清，得清，得LysateLysate；v5.5.根据所带标签纯化重组蛋白根据所带标签纯化重组蛋白
