1、细胞凋亡的细胞凋亡的DNA琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳o 细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosis）细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义：生物学意义：确保正常发育生长：清除多余的细胞确保正常发育生长：清除多余的细胞 维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞 积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制o 细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重
2、要和最具有特征性的改变是改变。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以在核小体连接部位断裂，形成以180200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段。为最小单位的单体或寡聚体片段。实验原理实验原理o 本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶
3、电泳上表或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱现为梯状电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞或，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊电泳后则成模糊的的“涂片状涂片状”。材材 料料1.凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞2.提取提取DNA：基因组：基因组DNA抽提试剂盒（抽提试剂盒（RNA酶、酶、蛋白酶蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等）标准品等）3.DNA电泳：电泳：1%的琼脂糖凝胶、点样缓冲液的琼脂糖凝胶、点样缓冲液
4、4.实验器材：实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、高速离心机、65水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪置、紫外透射仪 方方 法法一、胸腺细胞的制备：一、胸腺细胞的制备：小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含510%小牛血清的小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心离心5min，制成，制成1107细胞悬液备用。细胞悬液备用。二、提取胸腺细胞二、提取胸腺细胞DNA：裂解细胞阶段（使用
5、到的试剂：裂解液裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、液、RNaseA/蛋白酶蛋白酶K液液=A液）液）o 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100lL液和液和20lA液，充分混匀，置于液，充分混匀，置于55温浴温浴20分钟，其间来回颠倒离心管分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。次。(2)结合结合DNA阶段阶段(使用到的试剂使用到的试剂:结合缓冲液结合缓冲液=B液液、3MNaAC,pH4.8)o 加入加入10l 3MNaAC，随后加入，随后加入1250l B液，充液，充分振荡混合均匀（重要！），分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心离心3min
6、。将上清分。将上清分2次加入到离心吸附管。静置次加入到离心吸附管。静置1分钟，分钟，12000rpm离心离心30s，倒掉收集管中废液。，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置第二次同上，静置1分钟，离心分钟，离心30s。(3)漂洗阶段（使用试剂：漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液漂洗缓冲液2=W液）液）o 倒掉收集管中的废液，再加入倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，液，12000rpm离心离心30秒。秒。o 重复上叙步骤，再次加入重复上叙步骤，再次加入600 ulW液，液，12000rpm离心离心30秒。秒。o 倒掉废液，再次倒掉废液，再次12000rpm离心离心30秒。秒。(4)洗
7、脱收获（使用试剂：洗脱收获（使用试剂：50l洗脱缓冲液洗脱缓冲液=T液）液）o 小心取出离心吸附柱（不可沾上小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含液，因其中含有乙醇，会使提取有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干变性），将其套入一个干净的净的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中间小管中，沿吸附柱的正中间小心加入心加入50l T液，静置液，静置1分钟后，于分钟后，于12000rpm离离心心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组管中便是收集到的基因组DNA,取取10l电泳。电泳。三、三、DNA琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：(5)制板制板:将将1%的琼脂糖凝胶加
8、热溶化，取的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒倒板板,待凝待凝,取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。至淹没过胶。(6)加样：取加样：取50 uL DNA样品与样品与10uL点样缓冲液点样缓冲液,混混匀匀,10ul/孔。（孔。（DNA marker 直接加样，直接加样，5 ul/孔）。孔）。(7)电泳：点样孔置负极，电压电泳：点样孔置负极，电压80-100V，电泳至，电泳至溴酚兰移出溴酚兰移出2/3距离时，关闭电源。距离时，关闭电源。(8)观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿色色DNA区带。区带。注意事项：注意
9、事项：a 步骤步骤2中，加入中，加入B液后一定要充分混匀。离心后，液后一定要充分混匀。离心后，小心取出上清，小心取出上清，Tips头不可吸附上白色沉淀头不可吸附上白色沉淀（为基因组蛋白）。（为基因组蛋白）。b 漂洗阶段（步骤漂洗阶段（步骤3）一定要离心充分去除漂洗缓）一定要离心充分去除漂洗缓冲液，可适当将离心时间延长。冲液，可适当将离心时间延长。c 洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。结果观察结果观察o 加地塞米松培养的胸腺细胞加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型电泳后呈典型的的“阶梯状阶梯状”条带。未加地塞米松培养的胸腺条带。未加地塞米松培养的胸
10、腺细胞，细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照的无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。电泳呈现弥漫的片状图谱。地塞米松诱导小鼠胸腺地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡细胞凋亡1：DNA marker;2-3：细胞坏死对照：细胞坏死对照4-6：细胞凋亡；：细胞凋亡；7：正常细胞对照正常细胞对照基因组基因组DNADNA抽提试剂盒抽提试剂盒SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分离分离EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的酶活性，确保目的DNA不再降解不再降解Proteinase K：使染色质上蛋白质与：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为分离，并进一步降解为小肽小肽/氨基酸氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白质酚、氯仿：抽提除去蛋白质异丙醇：沉淀异丙醇：沉淀DNAGoldview：DNA萤光染料，与萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫结合形成一种光络合物，在紫外光下呈绿色萤光外光下呈绿色萤光
