1、第八章第八章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定(p114)第一节第一节 概述概述 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。等。蛋白质是生命的物质基础，人体蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋白是优良的蛋白质资源。白是优良的蛋白质资源。蛋白质是食品的最重要质
2、量指标，其含量与分解产物直接影响食蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。品的色、香、味。一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为16%，即，即1份氮相当于份氮相当于6.25份蛋白质，此数值份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质换算系数。）称为蛋白质换算系数。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中中20种，二在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯种，二在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和
3、缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必须氨基酸。合成，必须依靠食品供给，故被称为必须氨基酸。蛋白质的测定方法可分为两大类：蛋白质的测定方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。基团等测定蛋白质含量。食品和其原料中蛋白质含量的测定，最常用的方法是凯氏定氮法：食品和其原料中蛋白质含量的测定，最常用的方法是凯氏定氮法：它
4、是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一。该法是通过测出它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一。该法是通过测出样品中的总含氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的样品中的总含氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。目前，测定蛋白质和氨基酸含量的方法很多，如：目前，测定蛋白质和氨基酸含量的方法很多，如：双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等。国外：红外分析仪。氨双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等。国外：红外分析仪。氨基酸总量：酸碱滴定法测定。
5、各种氨基酸的分离与定量基酸总量：酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应（一）氨基黑法：（一）氨基黑法：氨基黑氨基黑10B是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。白质染料。经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑10B乙酸甲醇溶液中染色乙酸甲醇溶液中染色10min，染色后，用染色后，用10乙酸甲醇溶液洗涤乙酸甲醇溶液洗涤5-
6、7次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行洗脱，用洗脱，用0.1mol/L氢氧化钠浸泡氢氧化钠浸泡30min，于，于595nm波长下比色测定。波长下比色测定。氨基黑氨基黑10B乙酸甲醇溶液：乙酸甲醇溶液：13g氨基黑氨基黑10B溶解于溶解于100ml冰乙酸和冰乙酸和900ml甲甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次。醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次。聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：凝胶薄层的直接染色：凝胶薄层的直接染色：本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间
7、长，不同蛋白质染色强度不同。（二）溴酚蓝法：（二）溴酚蓝法：经电泳或层析后滤纸或凝胶于经电泳或层析后滤纸或凝胶于0.1溴酚蓝固定染色液溴酚蓝固定染色液（1g溴酚蓝，溴酚蓝，100g氯化汞溶于氯化汞溶于50乙醇水溶液中，用乙醇水溶液中，用50乙醇稀释至乙醇稀释至1000ml）中浸泡）中浸泡1520min，在，在30乙醇：乙醇：5乙酸水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用乙酸水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用0.1mol/L氢氧化钠。氢氧化钠。此法缺点是灵敏度低，某些低分子质量的蛋白质可能染此法缺点是灵敏度低，某些低分子质量的蛋白质可能染不上色。不上色。（三）考马斯亮蓝法：（三）考马斯亮蓝法：该染料和蛋白
8、质是通过范得华力结合的。考马斯亮蓝含有较多的疏该染料和蛋白质是通过范得华力结合的。考马斯亮蓝含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗较容易。如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗较容易。经电泳后滤纸或乙酸纤维膜在经电泳后滤纸或乙酸纤维膜在200g/L磺基水杨酸溶液中浸磺基水杨酸溶液中浸1min，取出，取出后放入后放入2.5g/L考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液中浸染色液中浸5min，在蒸馏水或，在蒸馏水或7乙酸中乙酸中洗四次，每次洗四次，每次5min，于，于90放
9、置放置15min。聚丙烯酰胺凝胶处理：凝胶用聚丙烯酰胺凝胶处理：凝胶用10三氯乙酸固定，在三氯乙酸固定，在10三氯乙酸三氯乙酸1考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250（191）中室温染色）中室温染色0.5h，用，用10三氯乙酸脱底色。三氯乙酸脱底色。考考 马斯亮蓝灵敏度比氨基黑高马斯亮蓝灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋电泳的微量蛋白质的染色。在白质的染色。在549nm处有最大吸收峰，蛋白质在处有最大吸收峰，蛋白质在1-10g呈线性关系。呈线性关系。（四）酸性品红法：（四）酸性品红法：经电泳后滤纸置于经电泳后滤纸置于0.2酸性品红溶液中（酸性品红溶液中（2g酸性品红溶解于酸
10、性品红溶解于500ml甲醇，甲醇，400ml蒸馏水和蒸馏水和100ml冰乙酸中）加热染色冰乙酸中）加热染色15min；取出后；取出后浸入乙酸甲醇溶液（浸入乙酸甲醇溶液（500ml甲醇，甲醇，400ml蒸馏水和蒸馏水和100ml冰乙酸）冰乙酸）15min；然后浸入然后浸入10乙酸溶液，每次乙酸溶液，每次20min，至背景无色为止。如欲进行比色，至背景无色为止。如欲进行比色，可用可用0.1mol/L氢氧化钠浸泡氢氧化钠浸泡2h，在波长，在波长570nm处比色。处比色。（五）氨基萘酚磺酸法：（五）氨基萘酚磺酸法：聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露在空气中几分钟，或在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露在空
11、气中几分钟，或在2mol/LHCl中浸一下使表层蛋白变性，再在中浸一下使表层蛋白变性，再在0.003氨基萘酚磺酸的氨基萘酚磺酸的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（Ph6.8）中染）中染3min，在紫外光下可显黄绿色荧，在紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性，光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性，可先在可先在3mol/LHCl中浸中浸2min以上使蛋白质充分变性，在染色。以上使蛋白质充分变性，在染色。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色：（一）糖蛋白的显色：1、过碘酸、过碘酸Schiff氏
12、试剂显色法：氏试剂显色法：试剂：过碘酸液；还原液；亚硫酸品红液；亚硫酸盐冲洗液等。试剂：过碘酸液；还原液；亚硫酸品红液；亚硫酸盐冲洗液等。显色步骤：将含有样品的滤纸浸在显色步骤：将含有样品的滤纸浸在70乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸液中浸5min，用，用70乙醇洗乙醇洗1次，在还原液中浸次，在还原液中浸5-8min，再用，再用70乙醇乙醇洗洗1次，在亚硫酸品红液中浸次，在亚硫酸品红液中浸24-25min，用亚硫酸盐冲洗液洗，用亚硫酸盐冲洗液洗3次，并次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底板上呈现用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑
13、灰色的底板上呈现紫红色。紫红色。2、甲苯胺蓝显色法：、甲苯胺蓝显色法：试剂：试剂：试剂甲：试剂甲：1.2g过碘酸溶解在过碘酸溶解在30ml蒸馏水中，加蒸馏水中，加15ml0.5mol/L乙酸钠和乙酸钠和100ml96乙醇。现配现用。乙醇。现配现用。试剂乙：试剂乙：100ml甲醇加甲醇加20ml冰乙酸及冰乙酸及80ml蒸馏水。蒸馏水。试剂丙：溴水，试剂丙：溴水，试剂丁：试剂丁：10g/L甲苯胺蓝水溶液，甲苯胺蓝水溶液，试剂戊：试剂戊：40g/L钼酸铵溶液。钼酸铵溶液。显色步骤：显色步骤：将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸15min，试剂丙溴水中浸，试剂丙溴水中浸15
14、min，用自，用自来水漂洗，再在试剂丁中浸来水漂洗，再在试剂丁中浸30min，自来水漂洗至没有蓝色染料渗出（，自来水漂洗至没有蓝色染料渗出（30-40min）后，再依次在试剂戊中浸）后，再依次在试剂戊中浸3min，试剂乙中浸，试剂乙中浸15min，丙酮中浸，丙酮中浸2min后后在空气中干燥。在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分染成蓝色，背景带有红紫色。显色结果：糖蛋白部分染成蓝色，背景带有红紫色。3、阿尔新蓝显色法：、阿尔新蓝显色法：聚丙烯酰胺凝胶在聚丙烯酰胺凝胶在12.5三氯乙酸中固定三氯乙酸中固定30min后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入1过碘酸过碘酸液（在液（在3乙
15、酸中）中氧化乙酸中）中氧化50min。用蒸馏水反复。用蒸馏水反复洗涤去除多余的过碘酸盐，再放入洗涤去除多余的过碘酸盐，再放入0.5偏重亚硫酸偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐钾中还原剩余的过碘酸盐30min，再用蒸馏水洗涤，再用蒸馏水洗涤，浸在浸在0.5阿尔新蓝（在阿尔新蓝（在3乙酸中）溶液中染乙酸中）溶液中染4h。（二）脂蛋白的显色：（二）脂蛋白的显色：1、苏丹黑显色法：、苏丹黑显色法：将将0.1g苏丹黑苏丹黑B溶解于煮沸的溶解于煮沸的100ml60的乙醇溶液中，制备成饱的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过滤两次，备用。和溶液，冷却后过滤两次，备用。显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，显色
16、时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h后取出，用后取出，用50乙醇乙醇溶液洗涤两次，每次溶液洗涤两次，每次15min，空气干燥。，空气干燥。聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑B到无水乙醇中成饱和液，到无水乙醇中成饱和液，并振摇使乙酰化。用前过滤。按样品液的并振摇使乙酰化。用前过滤。按样品液的1/10量加入样品液中染色量加入样品液中染色1h或或4过夜，染色后的样品再进行电泳。过夜，染色后的样品再进行电泳。2、油红、油红O显色法：显色法：0.04g油红油红O溶解于溶解于100ml60乙醇中，乙醇中，30放置过放置过夜（夜（16h）使充分饱和后，在）使充分饱和后
17、，在30下滤去多余的染料，澄清下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。液即可用于染色。将滤纸浸入染料液中，在将滤纸浸入染料液中，在30下染色下染色18h后，用水冲洗，后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。脂蛋白为红色，背景为桃红色。使背景变浅，在空气中干燥。脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在本法在30以下显色时，会引起染料沉淀。以下显色时，会引起染料沉淀。第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉左右，猪肉 9.5%，兔肉，兔肉
18、 21%，鸡肉，鸡肉 20%，牛乳牛乳 3.5%，带鱼，带鱼 18.0%，大豆，大豆 40%，面粉，面粉 9.9%，菠菜菠菜 2.4%，黄瓜，黄瓜 1.0%，苹果苹果 1.4%。测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。程控制均具有极其重要的意义。一些蛋白质的含氮量一般为一些蛋白质的含氮量一般为 15%17.6%，有的上下浮动，可以测，有的上下浮动，可以测出总氮出总氮 N
19、。一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 凯式定氮法可用于所有动植物食品的蛋白质含量测定，凯式定氮法可用于所有动植物食品的蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。由由Kieldhl于于1833年提出，经过长时间的改进，迄今已年提出，经过长时间的改进，迄今已演变为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法，演变为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法，书中只介绍前三种。书中只介绍前三种。（一）常量凯氏定氮法：（一
20、）常量凯氏定氮法：1、原理：、原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以标准盐酸合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。用用H3BO3吸收后再以标准吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算溶液滴定。根据标准酸消
21、耗量可以计算出蛋白质的含量。出蛋白质的含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准H2SO4或标准或标准HCl溶液吸收后再以标准溶液吸收后再以标准NaOH滴滴定过量的酸。定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。（1）样品消化：）样品消化：总反应式：总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，为碳
22、、氢、氮；浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原为二氧化硫。二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫酸则被还原为二氧化硫。二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。在消化反应中，为加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：在消化反应中，为加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：硫酸钾：作为增温剂，加入硫酸钾可以提高溶液沸点而加快有机物分解。纯硫硫酸钾：作为增温剂，加入硫酸钾可以提高溶液沸点而加快有机物分解。纯硫酸沸点酸沸点 340，至，至400以上。也可加入
23、硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。不如硫酸钾。硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。还可以指示消化终点的到达，以及下一步蒸硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。还可以指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒馏时作为碱性反应的指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。粉、二氧化钛。氧化剂：如双氧水、次氯酸钾等加速有机氧化剂：如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。物氧化速度。（2）蒸馏：）蒸馏：消化液消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。（3）吸
24、收与滴定：）吸收与滴定：用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。甲基红。指示剂：指示剂：红色红色绿色绿色红色红色 （酸）（碱）（酸）（碱）（酸）（酸）用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再用标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。的酸液，用甲基红指示剂。2、仪器、仪器 此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方法（此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方
25、法（GB/T5009.5-1985）。）。3、试剂、试剂4、操作方法、操作方法取样：固体样品取样：固体样品0.2-2g，半固态样，半固态样2-5g，液体样品，液体样品10-20ml。消化剂：硫酸铜消化剂：硫酸铜0.5g，硫酸钾，硫酸钾10g，浓硫酸，浓硫酸20ml。消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。以奈氏试剂以奈氏试剂Nessler试剂，试剂，K2（HgI4）检验）检验NH4+离子，遇铵根，离子
26、析出黄色或红棕离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。色沉淀。配制：配制：方法方法1：3.5 g KI+1.3 g HgCl2 溶于溶于70 毫升水。加毫升水。加30毫升毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方法方法2：溶解溶解11.5 g HgI2+KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。5、结果计算：、结果计算：式中：式中：cHCl标准溶液的浓度，标准溶液的浓
27、度，mol/L;V1滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml；V2滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml；m样品质量，样品质量，g；F氮换算为蛋白质的系数；氮换算为蛋白质的系数；M 1/2N2摩尔质量，摩尔质量，14.01g/moL。6、说明及注意事项：、说明及注意事项：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。化合物在
28、无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。体残渣洗下，并促进其消化完全。样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯
29、氏烧瓶冷却，加入当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈
30、长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。时发黑。硼酸吸收液的温度不应超过硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。可置于冷水浴中使用。蒸蒸 馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1
31、分钟后关掉热分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。源否则可能造成吸收液倒吸。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。色。（二）微量凯氏定氮法：（二）微量凯氏定氮法：1、原理：、原理：同常量凯氏定氮法。同常量凯氏定氮法。2、仪器、仪器3、试剂、试剂4、操作方法：、操作方法：与常量法不同点：与常量法不同点：加入硼酸量有加入硼酸量有50 ml 10 ml；滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L；可用微量滴定管。取样量较少。可用微量滴定管。取样量较少。样品消化步骤同常量法。
32、样品消化步骤同常量法。滴定：馏出液用滴定：馏出液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至微红色为终点。同标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。时做一空白试验。5、结果计算、结果计算6、说明：、说明：蒸馏前给水蒸气发生器内装水至蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3容积处，加甲基橙指容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。免水中的氨被蒸出而影响测定结果。20g/L硼酸吸收液每次用量为硼酸吸收液每次用量为25ml，用前加入甲基红溴，用前加入甲基红溴甲酚绿混合指示剂两滴。甲酚绿混合
33、指示剂两滴。在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应气，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。采用水封措施，以免氨由此逸出损失。（三）自动凯氏定氮法：（三）自动凯氏定氮法：是指将常量凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，其是指将常量凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，其原理与试剂与常量法相同，操作方法如下：原理与试剂与常量法相同，操作方法如下：称取称取0.50-1.00g样品，置于消化瓶内，加入硫酸铜和硫酸钾制成的片剂样品，置
34、于消化瓶内，加入硫酸铜和硫酸钾制成的片剂两片，加入浓硫酸两片，加入浓硫酸10ml，将消化瓶置于红外线消化炉中，用连接管密封，将消化瓶置于红外线消化炉中，用连接管密封住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉电源，住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉电源，30min后后8个样品消化完个样品消化完毕，消化液完全澄清并呈绿色。毕，消化液完全澄清并呈绿色。取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，连接开启加水电钮，加碱电钮、取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，连接开启加水电钮，加碱电钮、自动蒸馏滴定电钮，开启电源，约经自动蒸馏滴定电钮，开启电源，约经12min后由数显装置即可给出样品后由数显装置即可给出样品总氮百分含
35、量，并记录样品总氮百分比。根据换算系数总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据换算系数F即可得出样品即可得出样品中蛋白质含量。中蛋白质含量。开启排废液电钮和加水电钮，排出废液并对消化瓶进行清洗开启排废液电钮和加水电钮，排出废液并对消化瓶进行清洗1次。次。二、双缩脲法二、双缩脲法（一）原理：（一）原理：当脲（尿素，当脲（尿素，NH2CONH2）加热至）加热至150160时，两分子缩和时，两分子缩和成双缩脲。成双缩脲。NH2CONH2+NH2CONH2NH2CONHCONH2+NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩
36、脲反应（缩二脲反应）。反应（缩二脲反应）。由于蛋白质分子中含有肽键由于蛋白质分子中含有肽键 CONH，与双缩脲结构相似。，与双缩脲结构相似。故也能出现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下，其颜色深浅与故也能出现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸光度法来测定蛋白质含量，该配合物的蛋白质含量成正比，据此可用吸光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为最大吸收波长为 560nm。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化（二）方法特点及应用范围：（二）方法特点及应用范围：本法灵敏度
37、较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。（三）仪器：（三）仪器：分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000 r/min）。）。（四）试剂：（四）试剂：碱性硫酸铜溶液；四氯化碳。碱性硫酸铜溶液；四氯化碳。（五）操作方法：（五）操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。样品测定：准确称取样品适量（使蛋白质含量在样品测定：准
38、确称取样品适量（使蛋白质含量在40-110mg之间）于之间）于50ml纳氏比色管中，纳氏比色管中，加加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测定吸光度四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测定吸光度A。用测得的。用测得的A值在标准曲值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。（六）结果计算：（六）结果计算：蛋白质含量蛋白质含量m100/m1（mg/100g）式中：式中：m由标准曲线上查得的蛋白质质量，由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m1样品质量，样品质量，g。（七）说明及注意事项：（七）说明及注意事
39、项：蛋白质种类不同，对发色程度影响不大。蛋白质种类不同，对发色程度影响不大。标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。样品中有不溶性成分存在时，会给比色测得带来不便，此时样品中有不溶性成分存在时，会给比色测得带来不便，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测得。可预先将蛋白质抽出后再进行测得。当肽链中含脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会当肽链中含脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测得值偏低。使测得值偏低。碱性硫酸铜溶液由碱性硫酸铜溶液由0.1mol氢氧化钾、氢氧化钾、5g酒石酸钾钠，
40、酒石酸钾钠，1.6g硫酸铜溶于水后加水至硫酸铜溶于水后加水至1000ml配成。配成。三、紫外吸收法三、紫外吸收法（一）（一）A280nm光吸收法：光吸收法：1、原理：、原理：蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香环残基蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香环残基【NHCH（R）CO】在紫外区内对一定波长的光具】在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用，在波长（有选择吸收作用，在波长（280 nm）下，光吸收程度与蛋）下，光吸收程度与蛋白质浓度（白质浓度（38mg/mL）成直线关系，因此，通过测定蛋）成直线关系，因此，通过测定蛋白质的吸光度，并参照事先用凯式定氮法测定蛋白质含量的白质的吸
41、光度，并参照事先用凯式定氮法测定蛋白质含量的标准样所做的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。标准样所做的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。2、适用范围：、适用范围：本法操作简单迅速，常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应本法操作简单迅速，常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。用不广泛。3、仪器、仪器4、试剂、试剂5、操作方法：、操作方法：制作标准曲线：制作标准曲线：样品的测定：准确称取试样样品的测定：准确称取试样1.00g，如前处理，吸取的每毫升样品溶液中含有，如前处理，吸取的每毫升样品溶液中含有3-8mg的蛋白质。按标准曲线绘制的操作条件测定其吸光度，
42、从标准曲线上查得的蛋白质。按标准曲线绘制的操作条件测定其吸光度，从标准曲线上查得蛋白质的含量。蛋白质的含量。6、结果计算：、结果计算：蛋白质含量蛋白质含量m100（）（）式中：式中：m由标准曲线上查得的蛋白质质量，由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m1测定样品溶液所相当于样品的质量，测定样品溶液所相当于样品的质量，mg。7、说明及注意事项：、说明及注意事项：测定牛奶样品时的操作：准确吸取混合均匀的样测定牛奶样品时的操作：准确吸取混合均匀的样品品0.2ml于于25ml纳氏比色管中，用纳氏比色管中，用95-97的冰的冰乙酸稀释至标线，摇匀，以乙酸稀释至标线，摇匀，以95-97的冰乙酸为的冰乙酸为
43、参比液，用参比液，用1cm比色皿于比色皿于280nm处测定吸光度，处测定吸光度，并用标准曲线确定样品蛋白质含量。并用标准曲线确定样品蛋白质含量。测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20-30。（二）肽键紫外光测定法：（二）肽键紫外光测定法：蛋白质溶液在蛋白质溶液在238nm下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，根据这一性质，可测定样品在根据这一性质，可测定样品在238nm下的吸收值，与蛋白质标准溶液作下的吸收值，与蛋白质标准溶液作对照，求出蛋
44、白质含量。对照，求出蛋白质含量。本法比本法比280nm吸收法灵敏。在吸收法灵敏。在50-500mg/L蛋白质范围内呈良好的蛋白质范围内呈良好的线性关系。线性关系。A260nm和和A280nm比值法：比值法：1、原理：、原理：凡是有共轭双键的物质，均具有紫外吸收值。因此，若样品中含有凡是有共轭双键的物质，均具有紫外吸收值。因此，若样品中含有核酸，则嘌呤、嘧啶类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核核酸，则嘌呤、嘧啶类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核酸在酸在260nm处的紫外吸收值大于处的紫外吸收值大于280nm处的，但蛋白质刚好相反。利用处的，但蛋白质刚好相反。利用此性质，通过计算
45、可以适当校正核酸对测定蛋白质浓度的干扰。此性质，通过计算可以适当校正核酸对测定蛋白质浓度的干扰。2、测定：、测定：取一定量的样品稀释液，分别测定样品的取一定量的样品稀释液，分别测定样品的A260nm和和A280nm，计算，计算A280nm/A260nm的比值后，从表的比值后，从表10-2中查中查出校正因子出校正因子F值，同时可查出该样品中混杂的核酸质量分数。值，同时可查出该样品中混杂的核酸质量分数。将将F值代入，由下列公式可直接计算该样品的蛋白质含量：值代入，由下列公式可直接计算该样品的蛋白质含量：蛋白质含量蛋白质含量FA280nmn/d （mg/ml）式中：式中：A280nm该样品液在该样品
46、液在280nm波长下的吸收值；波长下的吸收值；d石英杯的厚度，石英杯的厚度，cm；n样品的稀释倍数。样品的稀释倍数。A215nm和和A225nm的吸收差法：的吸收差法：3、样品测定：、样品测定：取一定量的样品液，以蒸馏水调零，分别测定取一定量的样品液，以蒸馏水调零，分别测定A215nm和和A225nm，并求出差值，并求出差值A215nmA225nm，与蛋白质标，与蛋白质标准溶液吸收差值作对照，求出样品蛋白质含量。准溶液吸收差值作对照，求出样品蛋白质含量。本法在本法在20-100mg/L蛋白质范围内呈良好的线性关系。蛋白质范围内呈良好的线性关系。四、福林酚比色法四、福林酚比色法（一）原理：（一）
47、原理：蛋白质与福林（蛋白质与福林（Folin）酚试剂反应，产生蓝色复合）酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性酮盐产生双缩脲物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性酮盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。（二）试剂：（二）试剂：福林酚试剂甲，福林酚试剂乙，牛血清蛋白标准福林酚试剂甲，福林酚试剂乙，牛血清蛋白
48、标准溶液（溶液（100g/ml）。）。（三）操作方法：（三）操作方法：吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲3.0ml，置于，置于25水浴中保温水浴中保温10min，再加入试剂乙，再加入试剂乙0.3ml，立即混匀，立即混匀，保温保温30min，以介质溶液调零，测定，以介质溶液调零，测定A750nm值，与蛋白质值，与蛋白质标准溶液作对照，求出样品中的蛋白质含量。标准溶液作对照，求出样品中的蛋白质含量。本法在本法在060mg/L蛋白质范围呈良好线性关系。蛋白质范围呈良好线性关系。（四）说明：（四）说明：福林酚法灵敏度高，酚类和柠檬酸对该法均有干扰。福林酚法灵敏度高，酚
49、类和柠檬酸对该法均有干扰。五、考马斯亮蓝染料比色法五、考马斯亮蓝染料比色法（一）原理：（一）原理：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范得华引力是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范得华引力结合，使蛋白质染色，在结合，使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单迅速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似。测定。此法简单迅速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似。但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。（二）试剂：（二）试剂：牛血清蛋白标准溶液；牛血清蛋白标准溶液；染料试剂
50、：称取考马斯亮蓝染料试剂：称取考马斯亮蓝G-25060mg，溶于，溶于100ml,3过氯酸溶于中，过滤，储于棕色瓶中。过氯酸溶于中，过滤，储于棕色瓶中。（三）操作方法：（三）操作方法：吸取样品液吸取样品液2ml，加染料试剂，加染料试剂2ml，混匀，以介质溶于调零，测定，混匀，以介质溶于调零，测定A620nm，与蛋白质标准溶液对照，求出蛋白质含量。，与蛋白质标准溶液对照，求出蛋白质含量。本法在本法在0-100mg/L蛋白质范围呈良好的线性关系。蛋白质范围呈良好的线性关系。六、水杨酸比色法六、水杨酸比色法（一）原理：（一）原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度样品中的蛋白质
