1、National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab1石油降解菌石油降解菌Pseudomonas stutzeriPseudomonas stutz
2、eri RMRC PAH5RMRC PAH5奎林氧化還原酶純化與生化性質研究奎林氧化還原酶純化與生化性質研究National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskC
3、PR Lab2報告架構報告架構研究背景與現況研究目的文獻回顧研究架構研究方法結果與討論結論與展望National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab
4、3一一.石油主要成分包括飽和烴類、芳香族類、瀝青、樹脂等柏油類，並含有少量的氮、氧及硫化物。自工業革命以來，稱得上是最重要的能量及物質來源，其同時可以做為燃料以及石化工業原料的性質在現代甚至是近三十年內都占有舉足輕重的地位。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估
5、與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab4一一.在開採、運送、產製相關原料的過程中，因人為、設備失誤或交通意外而引起工業事故，導致大量之油品或石化相關物質洩漏至環境中。這些不屬於生物體且不存在於自然環境中之外來物質分解甚為緩慢。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and Technolo
6、gyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab5一一.大規模的原油洩漏對海生及陸生生物具有長期性危害，其中危害可以分為兩大類：物理性危害主要是原油黏度高，遮蓋海面造成透光性及通氣性下降威脅到海底生物化學性危害則是石油對生物具有直接毒性。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNat
7、ional Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab6一一.當石油洩漏到環境中若僅依靠自然的光分解和物化作用來清除的速度相對較緩慢，目前所採取的處理方式為下面三種：處理方式處理方式方法敘述方法敘述物理性物理性藉吸油棉、攔油繩(網)、沖洗法、高壓蒸氣洗除法和超音波震盪將懸浮於水中的油污打散或集中予以清除。化學性化學性使用分散劑(dispe
8、rsants)或界面活性劑(surfactants)藉此來增加油品的乳化性，使其呈現小油滴狀以利清除。生物性生物性以環境中之微生物來分解油污，具有不會造成二次污染之優點，由於石油的成分多半是碳氫化合物，是可以被微生物當作碳源或能量的來源，利用微生物進行降解可將複雜的大分子有機物分解成小分子。一般而言，利用微生物對 NAHs 進行生物分解有不錯的效率，但是這類微生物的分解能力較易受到真實環境因子的限制而降低其降解速率。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineeri
9、ngNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab7一一.Polycyclic aromatic Hydrocarbons(PAH)污染物中通常約 2/3 都含有雜環的結構，而含有 N 官能基的雜環化合物被稱為 NAHs(Nitrogen Heterocyclic Aromatic Hydrocarbons)。一般係由有機物
10、經過高溫(500800oC)狀態下不完全氧化的熱解作用與其他有機顆粒再結合所產生的。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab8一一.NA
11、Hs NAHs 在自然環境系統的降解途徑如下在自然環境系統的降解途徑如下 1.陽光照射而產生的光氧化作用(Photooxidation)進而被分解 2.在水體方面的物理作用上，污染物常因水體本身的流動而被乳化，形成所謂的乳膠(Emulsion)，這些被水所包覆的膠體 就會因重力作用而自然沉降水底並遭底泥吸附。3.最重要的主要降解途徑是以揮發方式，較光解或生物分解來得重要。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin Unive
12、rsity of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab9一一.本研究的對象是含氮雜環碳氫化合物中的奎林，此污染物是由兩個六碳環相連組成，其中一個碳環的第一個碳被氮元素所取代。相關衍生物是在第二、三或第四個碳的位置上被加上一個官能基(如圖)。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environm
13、ental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab10二二.研究目的研究目的 (1)(1)台灣本土所篩選出具降解奎林能力之菌株，以往研究中幾乎只針對生長最適化、酵素活性測試及代謝過程等生理作用機制進行探討。目前對於奎林氧化還原酶(Qor)的分子生物層面與其生化性質則未有較深入的探討
14、。本研究著重奎林氧化還原酶之純化與其生化性質探討 研 究 為 主 要 目 的，針 對 奎 林 降 解 菌 株 Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 的 Qor 進行研究。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制C
15、PR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab11二二.研究目的研究目的 (2)(2)若能只利用酵素製劑就達到油污分解的效果，即可避免去生物復育法對環境可能產生菌相甚至於是生態系的變化。站在減少環境衝擊的角度而言無寧是一個更好的選擇。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Envir
16、onmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab12三三.文獻回顧文獻回顧(1)(1)作者作者年代年代內容內容Coughlan等人等人1980研究中顯示能催化此種 hydroxylation 反應的酵素是一種含鉬的去氫酶。Tada等人等人1980目前在降解奎林的研究中發現，不同污染源所分離出的菌種(不論是好氧或厭氧菌)在降解奎林時的方式不外乎兩種代謝途徑。Shukla等人等人1986Pseudomonas putida Chin IK 則可利用 Coum
17、arin 或 Furan-2-carboxylate 當作主要的碳源，在此反應代謝作用中崁入環內的氧原子是由水分子衍生的，而並非直接來自於氧分子的介入，故一般認為 Pseudomonas putida Chin IK 的奎林代謝途徑是經由 coumarin pathway。Liu 等人等人1994針對厭氧環境下，Quinoline 在甲烷生成狀態下可被快速分解，硫酸還原態次之，在去硝化狀態下則不分解。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNation
18、al Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab13三三.文獻回顧文獻回顧(2)(2)奎林降解的分解情形奎林降解的分解情形某些分解菌以奎林當作基質利用其實仍需要經過一段時間的馴化動作，但直至馴化階段的菌株尚無法完全利用奎林作為唯一碳源，尤其是生長環境中有其它較易分解且可當作碳源來源的化合物，或是有抗生素存在的情況下。但PAH5的特性並非是
19、由一生長時期的結束來誘使另一階段的反應作用；相反的它是一種同時分解兩種以上化合物的代謝方式。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab14
20、三三.文獻回顧文獻回顧(3)(3)酶的特性酶的特性酶，泛指所有有機催化劑它具有幾種性質:1.在反應中不消耗或生成 2.不改變反應物生成的總量 3.每秒鐘可催化1000到100，000個分子在生物體內只需要很少量National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險
21、評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab15三三.文獻回顧文獻回顧(4)(4)各種輔因子介紹各種輔因子介紹酶在作用中的活性常來自於它的構型，為了維持構型有時候會需要金屬離子，這個一般會稱為輔因子金屬離子在酵素中的功能Fe過氧化酶Mn氧化光合作用Mo氧化還原酶W嗜熱菌中氧的傳輸ZnDNA，RNA 形成酶Ni氫化酶National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin
22、 University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab16三三.文獻回顧文獻回顧(5)(5)鉬酸鹽在菌體生長中的地位鉬酸鹽在菌體生長中的地位奎林的環狀結構被裂解時會衍生出一鎢酸鹽的物質，進而有效的抑制分解菌的生長，故一般來說奎林降解實驗的培養基中會添加鉬酸鹽(molybdstate)來達到專一性對抗的目的，以利菌種的生長並維持分解酵素的活性(Blaschke e
23、t al.，1991)。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab17三三.文獻回顧文獻回顧(6)(6)色層分析法的純化概述色層分析法的純
24、化概述色層分析法：係利用分離物在流動相中移動 的速度不同加以分離。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab18三三.文獻回顧文獻回顧(7
25、)(7)色層分析法與吸附模式色層分析法與吸附模式膠體一般可視為多孔性的小球體，而蛋白質則視為固相的顆粒。Langmuir的假設 1.同一處不會發生堆疊吸附 2.兩相近吸附點不會互相干擾 3.各吸附點的吸附能力相同National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風
26、險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab19三三.文獻回顧文獻回顧(8)(8)色層分析法與吸附模式色層分析法與吸附模式模式中參數介紹 :吸/脫附平衡常數 Vo:空白體積 (1-)*Vo/Vt:溶質分子(在此指蛋白質)保持自由不被膠體吸附的機率 Vt:總有效空間National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science an
27、d TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab20三三.文獻回顧文獻回顧(8)(8)色層分析法與吸附模式色層分析法與吸附模式溶質流率=Fout(1-)*Vo/Vt(理想式)此式可以用於調整管柱體積與流動相速率National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNationa
28、l Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab21三三.文獻回顧文獻回顧(9)(9)吸附簡化模式吸附簡化模式mt=m+q，pt=p+q，=q/pt取代q=pt，m=mt-q，p=pt-q可以得出Kp=m*p/q=mt*(1-)/p：蛋白質在溶液中總濃度 m：總有效結合位址 q：結合相的蛋白質濃度 Rf：溶質移動到液相中的移動率 Kp=(m
29、*p)/q：蛋白質與固定相的分離常數 =(1-Rf)：溶質的移動率 總有效吸附位址濃度為mt 總蛋白質濃度為pt(自由加結合)National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction
30、 of RiskCPR Lab22三三.文獻回顧文獻回顧(10)(10)離心回收數學模式離心回收數學模式T=9/2*/2*2*(o)*ln xb/xt：溶液動態黏度:離心陀角速度:顆粒的平均粒徑:含有懸浮顆粒的溶液平均密度0:空白溶液的密度 xb:離心管底到軸心的距離 xt:顆粒密度中心到軸心的距離National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.o
31、f Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab23三三.文獻回顧文獻回顧(11)(11)離心回收數學模式離心回收數學模式純水 o=1丙酮o=0.93無水蛋白質=1.34飽和蛋白質水溶液=1/2(1+1.34)=1.17其(o)=1.17-1=0.170而若以丙酮為溶劑則(o)=0.2藉由更換液相可以控制離心最低所需時間National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of E
32、nvironmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab24三三.文獻回顧文獻回顧(12)(12)離心回收數學模式離心回收數學模式飽和硫酸銨溶液在水中濃度約4 M，比重1.2353M磷酸鈉溶液在pH7.4時比重高達1.35(o)=(1.34+1.35)-1.35)0則T式不
33、成立，離心無法收集其中的蛋白質此式也可以應用於緩衝液的選擇National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab25菌體自休眠中活化離心收集擴大培養初
34、步馴化破菌處理離子交換管柱層析疏水性膠體管柱層析硫銨分劃膠體過濾管柱層析電泳檢定菌體收集段酵素粗抽段層析純化段酵素鑑定段四四.研究架構研究架構透析脫鹽過濾濃縮National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for co
35、ntrol&Prediction of RiskCPR Lab26五五.研究方法研究方法(1)(1)實驗菌種奎林降解菌：Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 【格蘭氏陰性(Gram negative)短桿菌，具運動性。在好氧環境環境下會生長，厭氧環境下不生長，不會產生內生孢子】National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.
36、of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab27五五.研究方法研究方法(2)(2)菌株的培養 以LB培養基批次培養至對數生長期後期菌體的收集 以離心機10000 rpm、離心時間10分鐘，收集菌體菌體的破碎：以超音波震盪在冰水浴中加以破碎，作用時間一秒鐘，冷卻時間一秒鐘為1循環，每20循環停機冷卻20秒，全部操作時間為15分鐘National Yunlin University of Science and TechnologyDep
37、t.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab28五五.研究方法研究方法(3)(3)將粗抽液以硫酸銨分劃做分離分離成五個Fraction，分別測定活性及蛋白質濃度將活性最高的分劃部分，冰存預備做為後續純化步驟所用National Yunlin Univ
38、ersity of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab29硫酸銨在液相中與水分子競爭吸附於蛋白質表面示意圖蛋白質分子蛋白質分子National Yunlin University of Sc
39、ience and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab30五五.研究方法研究方法(3)(3)選擇硫酸銨當鹽析工具的理由 1.中性且具有很大分子量 2.溶劑度在攝氏030度變化很小 3.溶液密度不影響蛋白質沉降 4.
40、可以與螯合劑結合保護酵素 5.高濃度鹽可抑制細菌及原生生物生長 6.便宜National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab31五五.研究方法研究方
41、法(4)(4)蛋白質濃度測定法 此定量方法利用Coomassie Brilliant Blue G-250會與蛋白質結合的特性，在coomassie blue與蛋白質結合後，其顏色會從棕紅色轉變成為藍色，此顏色變化在595nm波長光中有特殊吸收峰，可簡單的用分光光度計測定。必須配合標準品檢量線做內插法National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.
42、of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab32五五.研究方法研究方法(5)(5)蛋白質標準檢量線的製作:將BSA標準品配為10mg/ml再以連續稀釋的方法稀釋為1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1(mg/ml)五組，加入檢測用的染劑(coomassie blue 20%溶液)取標準品以1比50的比例加入染劑震盪使完全混合再靜置5分鐘後以A.595測定其吸光值。National Yunlin University of Scie
43、nce and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab33五五.研究方法研究方法(6)(6)有關酵素的定量有兩種性質，一個是酵素的總量另一個是酵素的活性。酵素總量可以用蛋白質濃度測定法測得之，但是有兩種問題會干擾;其中
44、之一是酵素純度問題，另一個問題是酵素活性不一定是100%。因此需要針對酵素活性做檢測National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab34五五.研
45、究方法研究方法(7)(7)檢測酵素活性，必須建立兩個前提:.活性定義 活性偵測法National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab35五五.研究方
46、法研究方法(8)(8)酵素確實的含量，通常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:1.以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少 unit(單位)的該種酵素活性。2.以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit(單位)的該種酵素活性。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmenta
47、l&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab36五五.研究方法研究方法(9)(9)酵素活性單位(unit)，一般係指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素催化使得基質減少或是產物增加的量。產物增加量mole 每一個活性 U=(反應時間-分鐘)National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin Universi
48、ty of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Prediction of RiskCPR Lab37五五.研究方法研究方法(10)(10)活性分析法係使用INT reduction方法，利用INT接受反應中產生的電子並呈現粉紅色的變化。INT=2-p-iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazolium chlorideINT平常時的溶液為無色微偏淡黃，接受電子之後的產物稱
49、為INT Formazan，為粉紅到紅色，此顏色在503nm波長下有特殊吸收峰，可為分光光度計所測得。必須配合標準品的檢量線做內插法National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制風險評估與損失控制CPR實驗室實驗室Lab for control&Predict
50、ion of RiskCPR Lab38五五.研究方法研究方法(11)(11)使用乙醇將INT formazan溶解懸浮並配成不同濃度的溶液，再模擬活性分析法中的濃度分配稀釋，然後測定其吸光值即可用做活性分析之用。National Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept.of Environmental&Safety Engineering風險評估與損失控制
