1、一、抗原组生产流程Ag组的操作流程组的操作流程 菌种接种菌种接种培养过夜培养过夜扩大培养扩大培养诱导诱导继续培养继续培养收集菌体收集菌体破碎菌体破碎菌体离心离心 沉淀沉淀包涵体纯化步骤包涵体纯化步骤可溶性蛋白可溶性蛋白纯化步骤纯化步骤 上清上清可溶蛋白具体生产步骤1 1、接种、接种80ul80ul菌种至菌种至100ml100ml抗性培养基中，抗性培养基中，3737度培养过夜。度培养过夜。2 2、次日加入新鲜抗性培养基至、次日加入新鲜抗性培养基至600ml600ml，培养，培养1.51.5小时至活力最旺盛。小时至活力最旺盛。3 3、加入、加入0.5mM0.5mM的的IPTGIPTG诱导诱导3.5
2、3.5小时小时4 4、收集菌体（、收集菌体（6666转转/秒秒15min),15min),弃上清，加入弃上清，加入PBSTPBST悬浮菌体，加入悬浮菌体，加入200ulMPMSF,100ul EDTA(his200ulMPMSF,100ul EDTA(his标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。5 5、摇床、摇床4 4度孵育度孵育1 1小时。小时。6 6、高速离心，、高速离心，133133转转/秒秒15min15min。取上清，加入。取上清，加入600ul beads600ul beads结合过夜。结合过夜。7 7、收集、收集beadsbeads（3333转转
3、/秒、瞬时），洗涤液洗涤秒、瞬时），洗涤液洗涤3 3次。加入次。加入300ul300ul洗脱液，洗脱液，4 4振荡振荡洗脱洗脱1 1小时，瞬时离心，取上清。再次加入小时，瞬时离心，取上清。再次加入300ul300ul洗脱液，洗脱洗脱液，洗脱1 1小时，两次洗脱液合为一管。小时，两次洗脱液合为一管。8 8、将所得的上清取、将所得的上清取10ul10ul加入加入10ulsample buffer 10ulsample buffer 制样，制样，SDS-PAGESDS-PAGE跑胶。跑胶。9 9、根据、根据maker maker 的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。二、实验原
4、理v基因的表达v亲和层析纯化可溶蛋白v包涵体的纯化原理vSDSPAGE电泳的基本原理三、基因的表达v在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为物增加，这种基因称为可诱导基因可诱导基因。可诱导基因在特定环。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。境中表达增强的过程，称为诱导。v如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基可阻遏基因因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 。v原核生物的基因调控主要发生在原核生物的基因调
5、控主要发生在转录水平转录水平上。原核生物的上。原核生物的基因表达主要是基因表达主要是负性调控负性调控，诱导物可用于去除阻遏作用。，诱导物可用于去除阻遏作用。v公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构 调控区调控区CAP结合位点结合位点启动序列启动序列操纵序列操纵序列调节基因调节基因ZYAOPDNAI 结构基因结构基因Z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y：透性酶透性酶A：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶（二）阻遏蛋白的负性调节（二）阻遏蛋白的负性调节mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏基因阻遏基因IDNAZYAOP没有乳糖存
6、在时没有乳糖存在时pol有乳糖存在时有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录启动转录mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白mRNA乳糖乳糖别乳糖别乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（三）CAP/CRP的正性调节vCAP(catabolite activator protein,分解代谢物激活蛋白分解代谢物激活蛋白)涉及到正性调节涉及到正性调节.CAP 又称为又称为 CRP(cAMP receptor protein),lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。高水平转录必需的一个激活蛋白。v葡萄糖抑制葡萄糖抑制 cAMP的形成。葡萄糖存在时，的形成。葡萄糖存在时，cAMP浓度低；浓度低；仅在葡萄糖消耗完
7、毕时仅在葡萄糖消耗完毕时,cAMP浓度增高。浓度增高。+转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP结合位点结合位点vlacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。分解代谢有关的酶得到持续表达。vlacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。这三种酶得到表达。v乳糖操纵子受到两种调节：乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调
8、节阻遏蛋白的负调节和和CAP的正的正调节调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时,即只即只有在有在缺乏葡萄糖并存在乳糖缺乏葡萄糖并存在乳糖时时,基因才能够转录。基因才能够转录。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白阻遏蛋白乳糖乳糖 别乳糖别乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol启动转录启动转录CAPcAMP（四）乳糖操纵子诱导物（四）乳糖操纵子诱导物v由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被-半乳糖苷酶半乳糖苷酶催化降解，并且产催化降解，并且产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操
9、纵子生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（IPTG)IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷，还可以是巯基半乳糖苷（TMGTMG）、）、O-O-硝基半乳糖苷（硝基半乳糖苷（ONPG)ONPG)。v IPTGIPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻可与阻遏物结合促进基因的表达。遏物结合促进基因的表达。IPTGIPTG能在缺乏能在缺乏lacYlacY基因下而有效地被运送，基因下而有效地被运送，不被大肠杆菌所分解所以浓度并不改变不被大肠杆菌所
10、分解所以浓度并不改变（五）影响蛋白表达的因素（五）影响蛋白表达的因素vIPTG浓度：0.1-1mM 0.5mMv诱导温度:28 37v诱导时间:3.5h四、亲和层析纯化可溶性蛋白v目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶转移酶(GST)融合蛋白和融合蛋白和6X HIS Tag融合蛋白。融合蛋白。v融合蛋白的优点有：融合蛋白的优点有：(1)表达效率高；表达效率高；(2)产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免细菌蛋白酶降解的最好措施；细菌蛋白酶降解的最好措施；(3)产生的蛋白质易于鉴定，纯化。产
11、生的蛋白质易于鉴定，纯化。v GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达表达方便而且基方便而且基 本不影响蛋白的活性本不影响蛋白的活性v亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的蛋白的一类特殊层析技术。（一）亲和层析技术原理（一）亲和层析技术原理v通常两个分子间特异亲和力的形成有两种情况：（1）两个分子之间，其构形有如积木般的互补，因为范德华力的关系，产生特异亲和力 （2）两分子之间，因为某些基团间产生了二级键，造成了吸引力。v亲和层析法按亲和配基的亲和力大小可分为两类（1）特异性配基亲和层析法，其配基，包括生
12、物素、激素、抗原等，KD值为10-710-15。（2）通用性配基亲和层析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等，KD值为10-410-6。（二）亲和层析法分类v利用了利用了GST与与GSH间间酶与底物酶与底物构象互补的特异性结合特性，构象互补的特异性结合特性，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。v GST fusion protein的洗脱原理是通过调节的洗脱原理是通过调节GSH浓度及洗浓度及洗脱时间将目的蛋白洗脱下来
13、脱时间将目的蛋白洗脱下来,洗脱液中的洗脱液中的还原型还原型GSH与与beads上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。脱。（三）（三）GST fusion protein的纯化的纯化 特异性配基亲和层析法特异性配基亲和层析法此图为此图为Glutathione sepharose的终端的终端结构，谷胱甘肽通过结构，谷胱甘肽通过SH基团与基团与sepharose基质的环氧乙烷基团通过环氧激活特基质的环氧乙烷基团通过环氧激活特异偶联到异偶联到sepharose上。上。此图为凝胶上的手臂谷胱甘肽与此图为凝胶上的手臂谷胱甘肽与GST-tagGST-
14、tag融合蛋白结合后结构，中间红色的部分融合蛋白结合后结构，中间红色的部分既为谷胱甘肽。既为谷胱甘肽。GST亲和纯化中常见的问题1SymptomsSymptomsPossible Possible CausesCausesCommentsComments结合在beads上的目的蛋白过少细胞裂解效果不好 延长破碎时间，加大破碎率表达的目的蛋白不溶通过抑制包涵体的形成来增加目的蛋白的可溶性目的蛋白自身的降解 细胞破碎后：加大蛋白酶抑制剂；操作过程保持低温，动作柔和，轻拿轻放。目的蛋白与beads结合时，pH值没调好 GST fusion protein与beads的结合对pH值是相当敏感的pH8.
15、0对结合不利。一般binding buffer pH=7.4蛋白结合后过度的洗涤 为避免将一些结合不牢固的目的蛋白洗下来，要限制洗涤次数GST亲和纯化中常见的问题2SymptomsSymptomsPossible CausesPossible CausesCommentsComments目的蛋白的洗脱效果不好目的蛋白分子量太大蛋白越大，洗脱效率越低。1.适当提高洗脱液中GSH的浓度；2.提高洗脱液的盐离子浓度（Nacl:100-500mM）；3.调节洗脱液的pH值，pH8.0洗脱效率大于pH=7.4；4.加大洗脱体积，延长洗脱时间SDS-PAGE检测后，发现杂带多目的蛋白降解 可1.使用较温和
16、的破碎条件；2.保持低温；3.避免破碎时蛋白产生气泡；4.加入还原剂如10mMDTT于裂解液中。杂蛋白的共纯化 可1.增加洗涤次数；2.提高binding buffer盐离子浓度（Nacl:500mM），可降低一些因为离子作用带来的非特异性吸附；3.延长破碎后蛋白的孵育时间及133转离心时间；4.缩短蛋白与beads binding时间（四）（四）6X HIS Tag蛋白的纯化蛋白的纯化 特异性配基亲和层析法特异性配基亲和层析法v蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够与多种过渡金蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够与多种过渡金属离子如属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+发生特殊的相互作用
17、。因此偶联发生特殊的相互作用。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。酸。vbeads与与6x His fusion protein间产生了共价键，结合力强间产生了共价键，结合力强但特异性差。组氨酸残基的五元但特异性差。组氨酸残基的五元咪唑环咪唑环是蛋白与是蛋白与Ni离子作用离子作用的关键的关键。u6x His fusion protein的洗脱原理是通过高浓度的咪唑洗脱目的蛋白，洗脱液中的咪唑通过和金属离子结合而高
18、效地替换掉His标签融合蛋白。u由于一些宿主细胞蛋白上也含有组氨酸，可以结合在beads上，洗脱时也会被洗脱下来（特异性差的原因）。因此在洗涤液中加入低浓度咪唑，可以避免宿主细胞蛋白的结合。HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题1SymptomsSymptomsPossible CausesPossible Causescommentscomments目的蛋白无法与beads结合蛋白降解1.加大蛋白酶抑制剂；2.操作过程保持低温，动作柔和，轻拿轻放。binding buffer pH有错误调整pH=7.5蛋白盐离子浓度太大结合前，稀释蛋白溶液目的蛋白His-tag隐藏目的蛋白水溶性差，自身折叠将H
19、is-tag包裹隐藏起来。可尝试在变性的条件下与beads 结合，确保beads工作良好的前提下，调整一下beads 结合的pH值；延长样品与beads 结合的时间 一些表达量很大的杂蛋白吸附于beads上，使目的蛋白无法吸附在目的蛋白与beads 结合时，向蛋白溶液内加入20mM咪唑减少非特异性吸附HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题2SymptomsSymptomsPossible CausesPossible CausesCommentsComments目的蛋白的洗脱效果不好目的蛋白本身带有一个金属离子结合域加大洗脱液中咪唑浓度SDS-PAGE检测杂带多宿主菌表达了一些能与HisTag 共同结合在beads上的杂蛋白原因：1.有些杂蛋白本身带有His残基，并暴露在蛋白的表面，2.金属螯合层析本身的特异性较弱，Ni离子不仅能与His残基中的咪唑环结合，还可与多个其他氨基酸残基中的基团结合1.在各buffer中都加一些非离子表面活性剂（如：Tween-20）可降低非特异性吸附；2.洗脱用阶段洗脱的方法；3.梯度降低pH可减弱蛋白与金属离子的作用力，特别适合洗脱吸附弱的蛋白，而阶段咪唑洗脱属于竞争性洗脱，可将一些吸附力强的蛋白洗下来。二者原理不同，相互配合可使单一靠咪唑洗不去的杂带洗掉。低pH也只4-5左右，短时间内蛋白不会变性，马上用碱中和即可。
