1、BSABSA毛细管电色谱柱的制备及手性毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用分离应用0202化工专业：化工专业：伍品端伍品端指导老师指导老师 ：马志玲马志玲 副教授副教授目录.研究意义和研究现状研究意义和研究现状.实验部分实验部分.结果与讨论结果与讨论.实验创新点实验创新点.研究意义和研究现状手性分离的重要性v 生物大分子几乎都具有生物大分子几乎都具有“手性手性”特征。特征。手性手性药物各对药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异映体的药效学等可能存在很大的差异 。v 因而评价手性药物各对映体的生物学活性因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、建立快速、准确、灵敏的准确、灵敏的对映体拆分对
2、映体拆分方法具有十分重要的意义。方法具有十分重要的意义。拆分对映体的色谱技术：v高效液相色谱高效液相色谱v高效毛细管电泳高效毛细管电泳v超临界流体色谱超临界流体色谱 毛细管区带电泳毛细管区带电泳胶束电动色谱胶束电动色谱毛细管电色谱（毛细管电色谱（CECCEC）(以电渗流为驱以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术动力的微柱液相色谱技术)对映体分离机理：手性选择剂与对映体主要为手性选择剂与对映体主要为疏水和静电作用疏水和静电作用 ，只有具备特定只有具备特定空间空间构形构形和化学官能团的分子才能与这一区域结合和化学官能团的分子才能与这一区域结合 。.研究意义和研究现状 CECCEC的的优点优点：CELC
3、CEC高效性高效性高选择性高选择性多功能性多功能性高效性、高选择性、多功能性高效性、高选择性、多功能性.研究意义和研究现状常用常用CECCEC手性选择剂手性选择剂人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵类粘蛋白、-酸性糖蛋白 等。手性引入手性引入方法方法u柱前手性衍生化法柱前手性衍生化法u手性流动相添加剂法手性流动相添加剂法 u手性固定相法手性固定相法.研究意义和研究现状 总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离机理，以电渗流为流动相驱动力。不仅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高选择性。而且，CEC整体柱在手性分离中也显示出一定优势。.研究意义和研究现状.实验部分
4、毛细管处理在毛细管内聚合整体柱基质用动态法在聚合整体柱基质上键合BSA蛋白使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离1.仪器和试剂（略）2.实验方法二、在毛细管内合成整体柱单体交联剂OOO+OOOOn三、键合BSA蛋白CHCH2OProtein-NH2CHH2COHHNEpoxy method 四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。分离对象：分离对象：D,L组氨酸组氨酸分离条件：分离条件：运行缓冲溶液：运行缓冲溶液：2mM磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 分离电压：分离电压：6kV检测方法：检测方法：电导检测电导检测5-1000100200300D-HisL-HisIntensity/mVUt/mi
5、n.实验结果与讨论一、整体柱基质聚合条件的优化二、整体柱分离D,L-组氨酸对映体活性基团活性基团IRIR渗透性渗透性背压背压孔结构孔结构SEMSEM、氮吸附法氮吸附法整体柱基质聚合条件的优化表1 整体柱各性能的影响因素最佳聚合条件最佳聚合条件 单体含量单体含量 交联剂含量交联剂含量 致孔剂含量致孔剂含量活性基团活性基团 渗透性渗透性 孔结构孔结构 环氧活性基团IR 环氧基环氧基和酯基分别和酯基分别在约在约910cm-1和和1730cm-1处处有吸收。有吸收。2997.002363.441729.481454.791259.281151.11907.32500100015002000250030
6、0035004000Wavenumber cm-1020406080100120140Transmittance%图1 整体柱基质的红外光谱图单体含量对整体柱活性基团含量的影响 固定致孔剂和溶剂的含量固定致孔剂和溶剂的含量，改变单体改变单体（）和交和交联剂联剂（）相对相对含量含量，用红外光谱法比较，用红外光谱法比较环氧基吸收环氧基吸收峰峰（约（约910910cmcm-1-1）和和酯基吸收峰酯基吸收峰（约（约17291729cmcm-1-1）峰面积。峰面积。OOOOOOO 样品号 单体/交联剂 环氧基峰面积 酯基峰面积 环氧基与酯基峰面积之比 1 3 3：2 2 33.4055 59.3904
7、0.5625 2 1：1 26.8072 49.1596 0.5453 3 2：3 26.3245 53.5184 0.4919表2 环氧基与酯基峰面积比较1.交联剂含量对整体柱背压的影响原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径 增大。增大。样品号样品号 单体单体/交联剂（交联剂（v/vv/v)流速（流速（mLmL/min)/min)背压（背压（MPaMPa）C3 C3#3:2 3:2 0.005 3.40.005 3.4 C6 C6#1:1 0.005 4.71:1 0.005 4.7 C7 C7#2:3 0.005 5.22:3 0.00
8、5 5.2表3 不同交联剂含量的整体柱基质背压2.致孔剂含量对整体柱背压的影响3035404550345678910Back Pressure/MPaporogen/%随着致孔剂（非良性溶随着致孔剂（非良性溶剂）用量增大，相分离剂）用量增大，相分离提前，孔径增大。提前，孔径增大。图2 不同致孔剂含量整体柱基质背压孔结构SEM图3 K1#（50%致孔剂）SEM图图4 K5#（10%致孔剂）SEM图样品号 单体 交联剂 溶剂 致孔剂 K1K1 24 16 10 5024 16 10 50 K5 K5 24 16 50 1024 16 50 10表4 整体柱基质组成 孔结构氮吸附法050010001
9、500200025000.00000.00010.00020.00030.00040.00050.00060.00070.0008Incremental Pore Volume/cm3.g-1Pore Width/Angstroms 该整体柱基质该整体柱基质的孔都是中孔和大的孔都是中孔和大孔，孔径分布在孔，孔径分布在5050nm-90nmnm-90nm范围内最范围内最多。多。图5 K1#（50致孔剂）孔径分布图单体:24%交联剂:16%致孔剂:50%溶剂:10%整体柱基质聚合条件CEC分离组氨酸对映体结果 在在6.0kV6.0kV的分离电压下，以的分离电压下，以2mmol2mmolL L1 1
10、，pHpH5.55.5磷磷酸盐缓冲溶液作运行液酸盐缓冲溶液作运行液 ，分离，分离D,L-D,L-组氨酸，所得组氨酸，所得CECCEC图。图。5-1000100200300D-HisL-HisIntensity/mVUt/min图6 D,L-组氨酸CEC图 表5 缓冲液的pH值对分离效果的影响结论 缓冲液作运行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，使保留时间越早。较高pH值的缓冲液作运行液时分离度下降是由于，正的电渗流较强，待分离对映体与手性选择剂的作用来不及很好地进行，就被带出毛细管。缓冲液缓冲液pHpH L-L-组氨酸组氨酸t tR R（minmin）D-
11、D-组氨酸组氨酸t tR R（minmin）分离度分离度R R5.0 5.0 5.5 6.23 6.68 1.05.5 6.23 6.68 1.06.0 5.02 5.56 0.46.0 5.02 5.56 0.4实验创新点 通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸附法等方法，确定出最佳聚合条件，成功制备出毛细管电色谱柱。用手性毛细管电色谱柱分离组氨酸对映体，并考察了运行缓冲液pH值对柱效及分离度的影响,并从原理上作出解释。最简便的方法（环氧基法），用BSA蛋白对毛细管整体柱进行修饰，制成手性毛细管电色谱柱。首次建立了采用IR法定性和定量分析整体柱基质表面的活性基团。前景展望v 目前，目前
12、，CECCEC在药物分析方面在药物分析方面已有广泛的已有广泛的研究，集中在与药物研究，集中在与药物相关的杂质分离和相关的杂质分离和手性药物手性药物的的分离分离等。等。v 随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等环境保护、农业化学、精细化工产品、食品工业等多个多个领域领域的的分析中得到应用分析中得到应用。v 在可预计的将来，在可预计的将来，CECCEC作为一种发展中的作为一种发展中的快速快速分离技术分离技术，将有更广泛的应用前景。将有更广泛的应用前景。致谢v感谢创新化学实验与研究基金项目v感谢导师马志玲副教授的悉心指导v感谢凌连生、谢天尧、曾锋、邹世春等老师的关心和帮助v感谢师兄师姐和朋友们对我的鼓励和帮助
