1、造血和淋巴组织肿瘤 Tumours of haematopoietic and lymphoid tissues,WHO分型,Lymphoid neoplasms：淋巴系肿瘤 Myeloid neoplasms：髓系肿瘤,Lymphoid neoplasms：淋巴系肿瘤,Precursor lymphoid neoplasms：前驱淋巴细胞肿瘤 Mature B-cell neoplasms：成熟B细胞肿瘤 Mature T-and NK-cell neoplasms：成熟T 细胞和NK 细胞肿瘤 Hodgkin lymphoma：霍奇金淋巴瘤 Immunodeficiency-associa
2、ted lymphoproliferative disorders：免疫缺陷相关的淋巴系增值型疾病 Histiocytic and dentritic cell neoplasms：组织细胞和树突细胞肿瘤,B-cell分化和主要B-CELL肿瘤的关系,T-cell分化和主要T-CELL肿瘤的关系,MICM,MICM分型与临床特征相结合，与治疗和预后相关 形态学（orphology） 免疫学（Immunology） 细胞遗传学（Cytogenetics） 分子生物学（olecularbiology）,B淋巴细胞成熟阶段表型,T淋巴细胞成熟阶段表型,Precursor lymphoid neopl
3、asms 前驱淋巴细胞肿瘤,B lymphoblastic leukaemia/lymphoma, not otherwise specified B lymphoblastic leukaemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities T lymphoblastic leukaemia/lymphoma,Mature B-cell neoplasms 成熟B细胞肿瘤,Chronic lymphocytic leukaemia / small lymphocytic lymphoma B-cell prolymphocytic leukae
4、mia Splenic marginal zone lymphoma Hariy cell leukaemia Splenic lymphoma/leukaemia, unclassifiable Lymphoplasmacytic lymphoma Heavy chain disease Plasma cell neoplasms Burkitt lymphoma,FAB：ALL,L1： 以小细胞为主，大小较一致，染色质较粗，核仁小，不清，胞质量少。 L2： 以大细胞为主，大小不一，染色质较疏松，核仁较大，一至多个，胞质量中等。 L3： 以大细胞为主，大小较一致，染色质细点状，均匀，核仁一至
5、多个且明显，胞质嗜碱，空泡易见。 B、T祖细胞ALL：L1L2 伯基特细胞白血病: B，L3为主,ALL(L1,L2,L3),ALL(L1,L2,L3),慢性淋巴细胞白血病 chronic lymphocytic leukemia, CLL,多见于老年人,95%为B淋巴细胞型. 血象:一般在发现时,淋巴细胞已达40*109/L,几乎全为成熟淋巴细胞. 髓象:淋巴细胞显著增多,占40%以上;原淋巴细胞2%.,多发性骨髓瘤 Multiple Myeloma,多发性骨髓瘤是异常浆细胞在骨髓内极度增生的恶性肿瘤,表现为溶骨性破坏、贫血、肾功能障碍及免疫球蛋白异常。 血象：晚期可有贫血、红细胞多呈缗钱状
6、，血沉显著加速。白细胞正常或轻度增高，少数亦可减少。分类中可见幼红细胞、幼粒细胞、奖细胞或骨髓瘤细胞。血小板正常或减低。 髓象：增生活跃或明显。粒、红、巨三系细胞形态正常，其数量随瘤细胞的增生而减少。多数病人的骨髓瘤细胞占30%以上（1090%）。 浆细胞样骨髓瘤细胞 组织细胞样骨髓瘤细胞 淋巴样浆细胞 小原浆细胞 火焰状骨髓瘤细胞 Mott细胞(桑椹形浆细胞) 双核或多核骨髓瘤细胞,流式细胞术光信号检测,光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC); 侧向散射光(side scatter, SSC). 荧光信号 自发
7、荧光 (细胞色素因子、核黄素)：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。,1.2.1 散射光信号,（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。,（二）侧向散射光SSC,SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。,（三）散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,FCM数据显示方式,单参数直方图(H
8、istogram) 双参数数据显示： 散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot) 三维图(3D Plot),常用分析软件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express,直方图Histogram,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。,Counts,FITC荧 光强度,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。,DNA倍体分析,抗原表达分析,Over
9、lay图,散点图,散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。,设门与数据分析,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。,椭圆形,圆形,免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。,荧光抗体,荧光二抗,第一抗体,直接标记,间接标记,一般检测时，获取12万个细胞，标记0.51106细胞即可。 下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低 ,0.51106个
10、细胞,孵育体积50-100ul,上机体积200-500ul 终浓度约1106个/ml,加染料,洗涤后补加液体,细胞表面抗原标记,2.3 对照的设置,空白对照 细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。 设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。,流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。,001,001,002,阳性对照Positive Control,设置阳性对照是为了
11、检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置： 使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。 设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。,单标对照Single Staining Control,两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节； 单标实验时不需要。,2.4 光谱重叠与补偿,当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检
12、测到，这种现象就是光谱重叠(spectral overlap)。,FL1 530/30,FL2 585/42,发射波长,FITC发射谱,PE发射谱,实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescence compensation)。,FL2 - %FL1,FL-1(FITC),FL-2(-),FL-1(-),FL-2(PE),FL1 - %FL2,补偿前,补偿后,FITC单标,PE 单标,免疫细胞亚型检测,CD分子是细胞(包括白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞等)在分化为不同谱系(lineage)、不同阶段以及活化过程中或疾病
13、状态下出现或消失的细胞表面标记。,免疫细胞特征表型,Granulocytes,Monocytes,Basophils,Lymphocytes,Peripheral White Blood Cells CD45+,CD3+,CD3- CD19+,CD3- CD16+ CD56+,Monocytes,CD14+,3.4.1 淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为： T淋巴细胞(CD3+)，与细胞免疫有关； 辅助性T细胞 (CD3+CD4+)：helper T cells，Th细胞； 细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)：Cytotoxic T cells，Tc细胞。 B淋巴细胞(CD19+)，
14、与体液免疫有关； NK细胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,FSC,SSC,CD3 PerCP,SSC,CD4 FITC,CD8 PE,42.04%,48.3%,1.8%,13.9%,35.9%,T淋巴细胞亚群分析,CD3 PerCP,CD4 FITC,CD8 PE,42.82%,37.41%,49.68%,T细胞、B细胞和NK细胞比例检测,健康成年人外周血淋巴细胞参考范围,实验流程,标记上样管：同型、FITC、PE、APC、样品 加抗体（按下表）加至管底 1. 同型对照：IgG1 FITC 3ul、IgG1 PE 3ul
15、、IgG1 APC 1ul 2. FITC单阳：CD4-FITC 5ul、IgG1 PE 3ul、IgG1 APC 1ul 3. PE单阳： IgG1 FITC 3ul、CD8-PE 5ul、IgG1 APC 1ul 4. APC单阳：IgG1 FITC 3ul、IgG1 PE 3ul、CD3-APC 3ul 5. 样品： CD4-FITC 5ul、CD8-PE 5ul、CD3-APC 3ul,实验结果,同型对照,FITC单阳,PE单阳,APC单阳,样 品,Myeloid neoplasms：髓系肿瘤,Myeloproliferative neoplasms：骨髓增生性肿瘤 Myeloid a
16、nd lymphoid neoplasms with eosinophilia and abnormalities of PDGFRA,PDGFRB or FGFR1：髓系和淋巴系肿瘤伴嗜酸性粒细胞增多和PDGFRA,PDGFRB or FGFR1异常 Myelodysplasitc/myeloproliferative neoplasms：骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤 Myelodysplasitc syndromes ：骨髓增生异常综合征 Acute myeloid leukaemia (AML) and related precursor neoplasms：急性髓系白血病(AML) 和
17、相关前驱细胞肿瘤 Acute leukaemias of ambiguous lineage：急性未定系列白血病,Acute myeloid leukaemia (AML) and related precursor neoplasms 急性髓系白血病(AML) 和相关前驱细胞肿瘤,Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities：伴重复基因异常的急性髓系白血病 Acute myeloid leukaemia with myelodysplasia-related changes ：伴发育不良相关改变的急性髓系白血病 Th
18、erapy-related myeloid neoplasms:治疗相关髓系肿瘤 Acute myeloid leukaemia, not otherwise specified：急性髓系白血病，分类未明 Myeloid sarcoma：骨髓肉瘤 Myeloid proliferations related to Down syndrome：唐氏综合征相关的骨髓增殖 Blastic plasmacytoid dentritic cell neoplasm：原始类浆细胞样树突细胞肿瘤,MICM,MICM分型与临床特征相结合，与治疗和预后相关 形态学（orphology） 免疫学（Immunolo
19、gy） 细胞遗传学（Cytogenetics） 分子生物学（olecularbiology）,FAB分型（30%，而WHO 20%）,M0 急性髓细胞性白血病微分化型； M1 急性粒细胞白血病未分化型； M2 分两型，M2a原始粒细胞白血病部分分化型、 M2b以异常的中性中幼粒细胞增生为主； M3 颗粒增多的早幼粒细胞白血病， 又分为两型，即M3a(粗颗粒型)、 M3b(细颗粒型）； M4 粒-单核细胞白血病，此型白血病骨髓中及外周血中有粒系及单核细胞系两种细胞均增生； M4E0 M5 单核细胞白血病；根据分化程度，又分为M5a(未分化型) 、 M5b(部分分化型) M6 红白血病 M7 急性
20、巨核细胞白血病,NEC，non-erythroid count,即非红细胞计数，指除去幼红细胞、淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞、巨噬细胞外的有核细胞百分比,Acute non-lymphocytic leukemia,ANLL,骨髓增生明显活跃或极度活跃。 可见某一系或多系原始和幼稚细胞增生。原始细胞30%(NEC)。（WHO：大于20%） 细胞成熟障碍 ：裂孔现象，大量原始细胞伴少量成熟细胞。 细胞形态畸形：细胞大小、外形和核浆 细胞分裂异常 骨髓中其他系细胞受抑制,急性原粒细胞白血病未分化型 ANLL-M1,骨髓增生极度活跃或明显活跃，少数病例增生活跃甚至减低。 原始细胞90%(NSE)。早幼
21、粒细胞很少，中幼粒细胞及以下各阶段细胞罕见或不见。 在少数病例白血病细胞内可见Auer小体，核分裂细胞较多见。 多数病例幼红细胞及巨核细胞明显减少，淋巴细胞也减少。 原理粒细胞II型:形态与原粒细胞相似,但胞浆有少数颗粒,奥尔(Auer)氏体,是含于胞浆内的一种被染成红色的棍棒状小体。一般认为它是嗜天青颗粒融合而成，过氧化物酶和PAS反应都呈阳性。 正常细胞中见不到，多见于急性白血病时原始、早幼粒细胞和幼稚单核细胞胞浆中，但决不会出现于淋巴和红细胞中，故对白血病的鉴别有一定价值。,急性原粒细胞白血病部分分化型 ANLL-M2a,骨髓增生极度活跃或明显活跃. 原始细胞占3089%(NSE)，并可
22、见到早幼粒细胞、中幼粒细胞和成熟粒细胞10%， 约50%病例白血病细胞内可见Auer小体，核分裂细胞较多见。 幼红细胞及巨核细胞明显减少，淋巴细胞也减少。 特征：是形态变异及核质发育不平衡，表现为细胞大小异常，形态多变，胞体畸形有瘤状突起，核形畸变，如凹陷、折叠、扭曲、肾形、分叶等，也可表现为核发育迟缓，胞质出现少数嗜苯胺蓝颗粒。,ANLL-M2b,骨髓增生明显活跃或增生活跃。 红细胞系及巨核细胞系增生均减低。 粒细胞系增生明显活跃，原始粒细胞及早幼粒细胞明显增多，以异常中性中幼粒细胞为主，30%(NEC)。 异常中性中幼粒细胞：形态明显异常，核浆发育显著不平衡，核染色质细致、疏松，有12个大
23、而清楚的核仁，与原粒细胞的核结构相似，但胞浆中已有较多细小而分布较密集的特异性中性粒细胞，胞体较大，核可不规则，胞浆丰富，易见空泡。,急性颗粒增多的早幼粒细胞白血病 ANLL-M3,多数病例增生明显或极度活跃，个别病例增生低下。 分类以颗粒增多的异常早幼粒细胞为主，30(NSE)，其胞核大小不一，胞浆中有大小不等的异常颗粒，部分病例早幼粒细胞胞浆中有Auer小体，有的病例一个细胞可有数至数十根，呈柴捆样排列，称为“柴捆细胞”。根据胞浆中颗粒的大小又将M3型分为两种亚型。 M3a（粗颗粒型）：胞浆中嗜苯胺蓝颗粒颗粒粗大，密集或融合，染深紫红色，可掩盖核周围甚至整个细胞。 M3b（细颗粒型）：胞浆中嗜苯胺蓝颗粒密集而细小，核扭曲、折叠或分叶，易与急单白血病混淆。,ANLL-M3a/M3b,
