1、第第1讲微生物的利用讲微生物的利用大肠杆菌的培养和分离。分离以尿素为氮源的微大肠杆菌的培养和分离。分离以尿素为氮源的微生物。生物。知识点一大肠杆菌的培养和分离知识点一大肠杆菌的培养和分离1大大肠杆菌：革兰氏肠杆菌：革兰氏、兼性厌氧的肠道杆菌。、兼性厌氧的肠道杆菌。2细菌的繁殖：以细菌的繁殖：以 的方式繁殖，分裂速度很快。的方式繁殖，分裂速度很快。3细菌的扩大培养：用细菌的扩大培养：用 培养基，划线分离培养基，划线分离用用 培养基。培养基。4大肠杆菌的分离操作技术大肠杆菌的分离操作技术最常用方法是划线分离法，其操作步骤是：最常用方法是划线分离法，其操作步骤是：a培养基灭菌：将配制好的培养基灭菌：
2、将配制好的50 mL LB液体培养基和液体培养基和50 mLLB固体培养基分别装入两个固体培养基分别装入两个250 mL的三角瓶中，加的三角瓶中，加上封口膜，用上封口膜，用 进行灭菌。进行灭菌。阴性阴性分裂分裂LB液体液体LB固体平面固体平面高压锅高压锅b倒平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在倒平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养个培养皿中，使培养基铺平培养皿底部，待凝，使之形成平面。皿中，使培养基铺平培养皿底部，待凝，使之形成平面。c接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的瓶的中，三角瓶在中，三角瓶在37，每分钟，每
3、分钟20转的摇床转的摇床中振荡培养中振荡培养12 h。d划线分离：将摇床上培养划线分离：将摇床上培养12 h的菌液在固体培养基的平的菌液在固体培养基的平板上板上 ，然后将盖好的培养皿倒置，放在，然后将盖好的培养皿倒置，放在37 恒温恒温培养箱中进行培养，培养箱中进行培养，1224 h后，可看到在划线的末端出现后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。不连续的单个菌落，表明菌已被分离。液体培养基液体培养基连续划线连续划线e菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用法接种在空白斜面上，在法接种在空白斜面上，在37 下培养下培养
4、24 h后，置于后，置于4 冰箱中保存。冰箱中保存。思考思考1：灼灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？提示：提示：以免接种温度太高，杀死菌种。以免接种温度太高，杀死菌种。划线划线知识点二分离以尿素为氮源的微生物知识点二分离以尿素为氮源的微生物1实实验原理：不同微生物利用氮源种类验原理：不同微生物利用氮源种类 。有一些细。有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生脲酶的降解下产生，使培养基的，使培养基的pH由原来的中性变由原来的中性变为为 ，于是培养基中的酚红由红黄
5、色变成，于是培养基中的酚红由红黄色变成 。2实验步骤实验步骤(1)制备培养基：在制备培养基：在60 左右时，将两个三角瓶中已灭菌左右时，将两个三角瓶中已灭菌的的LB固体培养基和固体培养基和 固体培养基，在酒精灯旁分别固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，摇匀后平放至凝固。倒入两个培养皿中，摇匀后平放至凝固。不同不同NH3红色红色尿素尿素碱性碱性(2)制备细菌悬液：将土样制备细菌悬液：将土样1 g，在无菌条件下，加到有，在无菌条件下，加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即成，即成102土壤稀释液，依土壤稀释液，依此方法制备出此方法制备出103、104和
6、和105的土壤稀释液。的土壤稀释液。(3)涂布法分离：取涂布法分离：取0.1 mL稀释稀释104和和105的土壤稀释液，分的土壤稀释液，分别加到有别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，用培养基和尿素培养基的培养皿中，用 灭灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上。菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上。(4)培养和观察：在培养和观察：在37 恒温箱中培养恒温箱中培养2448 h，观察，观察 。灼烧法灼烧法菌落数菌落数3预测本实验的结果：预测本实验的结果：LB全营养固体培养基上的菌落全营养固体培养基上的菌落；尿素固体培养基上的菌落；尿素固体培养基上的菌落 ，一定时间，一定时间内，菌落周围出现内，菌落
7、周围出现 区域。用浓度为区域。用浓度为104和和105土壤土壤稀释液接种，更容易形成单菌落的是稀释液接种，更容易形成单菌落的是105土壤稀释液。土壤稀释液。思考思考2：在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？提示：提示：不能，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的不能，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。多而杂多而杂少而纯少而纯红色红色(1)菌
8、液划线分离的方法菌液划线分离的方法(2)分离以尿素为氮源的微生物注意事项分离以尿素为氮源的微生物注意事项选择培养基：以尿素为唯一氮源；选择培养基：以尿素为唯一氮源；以以LB全营养基为对照；全营养基为对照；培养基需高压蒸汽灭菌；培养基需高压蒸汽灭菌；通过通过G6玻璃漏斗过滤尿素溶液使之无菌。玻璃漏斗过滤尿素溶液使之无菌。(3)培养基的制作是否合格的验证：如果未接种的培养基在恒培养基的制作是否合格的验证：如果未接种的培养基在恒温箱中保温温箱中保温12天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。的，否则需要重新制备。判断正误判断正误(1)对对异养
9、微生物来说，含异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物既是碳源，的有机物既是碳源，又是氮源又是氮源()(2)病毒与细菌不同，不能用普通培养基培养，而是用活细胞病毒与细菌不同，不能用普通培养基培养，而是用活细胞培养，常用于培养病毒的是活鸡胚培养，常用于培养病毒的是活鸡胚()(3)大肠杆菌是革兰氏阳性厌氧型的肠道杆菌，在肠道中一般大肠杆菌是革兰氏阳性厌氧型的肠道杆菌，在肠道中一般对人有害对人有害()(4)单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一高表达量菌株的最简便方法之一()微生物的培养与分离微生物的培养与分离
10、 高考地位：高考地位：5年年3考考(2011全国课标卷，全国课标卷，2009宁夏高宁夏高考考)【典例典例1】(宁夏理综卷宁夏理综卷)(1)在在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行养基和培养器皿进行_(消毒
11、、灭菌消毒、灭菌)；操作者的双；操作者的双手需进行清洗和手需进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的落特征对细
12、菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。解析解析本题主要考查微生物培养的综合知识。消毒一般只是本题主要考查微生物培养的综合知识。消毒一般只是消灭物体表面或内部一部分微生物，而灭菌是杀灭所有的微消灭物体表面或内部一部分微生物，而灭菌是杀灭所有的微生物及孢子等。生物及孢
13、子等。答案答案(1)温温度酸碱度易培养生活周期短度酸碱度易培养生活周期短(2)灭菌灭菌消毒损伤消毒损伤DNA的结构的结构(3)比例合适比例合适(4)鉴定鉴定(或分类或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生养基上是否有菌落产生(6)灭菌灭菌培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物的分离、纯化和培养培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物的分离、纯化和培养过程及菌液划线分离与涂布分离法是近年高考的热点与焦点过程及菌液划线分离与涂布分离法是近年高考的热点与焦点所在，预计所在，预计2011年高考仍会呈现，题型为非选择
14、题。年高考仍会呈现，题型为非选择题。1微生物接种两种常用方法比较微生物接种两种常用方法比较 比较比较划线分离法划线分离法涂布分离法涂布分离法工具工具接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀原理原理通过接种环在琼脂固体通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌释，然后将不同稀释度的菌液分
15、别涂布到琼脂固体培养液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落表面形成单个的菌落特特点点方法简单，但不适方法简单，但不适宜计数宜计数单菌落更易分单菌落更易分开，但操作复开，但操作复杂些杂些目目的的使培养基上形成单个细胞繁殖而来使培养基上形成单个细胞繁殖而来的子细胞群体的子细胞群体菌落菌落2大肠杆菌及其培养与分离大肠杆菌及其培养与分离(1)特特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠
16、道杆菌。(2)用途：是基因工程技术中被广泛采用的受体细胞。用途：是基因工程技术中被广泛采用的受体细胞。(3)培养：实验中用培养：实验中用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌。液体培养基扩大培养大肠杆菌。(4)分离分离(实验部分实验部分)(5)保存菌种：用接种环取出单个菌落，用划线法接种在斜面保存菌种：用接种环取出单个菌落，用划线法接种在斜面上，上，37 培养培养24 h后，后，4 冰箱保存。冰箱保存。微生物培养与分离微生物培养与分离“关键点关键点”归纳归纳(1)进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面如果正放培养皿，则
17、皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。(2)培养后判断是否有杂菌污染的方法培养后判断是否有杂菌污染的方法从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。用显微镜镜检观察菌
18、的形态、大小，看是否有菌丝、孢子、用显微镜镜检观察菌的形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。标。上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢等。子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢等。选择培养基应用实例选择培养基应用实例(1)培培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。养基中加入青霉素可以分离
19、出酵母菌和霉菌。(2)培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。(3)培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。微生物不能在此培养基上生存。(4)当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的
20、微生物的目的。石油污染的微生物的目的。(5)改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。【训练训练1】平平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列描述正确的是方法，下列描述正确的是()。A都要将菌液进行一系列的梯度稀释都要将菌液进行一系列的梯度稀释B平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作培养基表面连
21、续划线的操作C稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养基进行培养D都会在培养基表面形成单个的菌落都会在培养基表面形成单个的菌落解析解析平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法是平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液滴加到固体培养基的表面。平板划线法将不同稀释度的菌液滴加到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。答案答案D【训练训练2】从从自然菌样筛选较理想生产菌种的一般步骤是采集菌样自然菌样筛选较理想生产菌种的一般步骤是采集
22、菌样富集培养富集培养纯种分离纯种分离性能测定。如图是采用纯化微性能测定。如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解。下列生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解。下列相关叙述错误的是相关叙述错误的是()。A不同微生物的生存环境不同，培养噬盐菌的菌样应从海不同微生物的生存环境不同，培养噬盐菌的菌样应从海滩等高盐环境采集滩等高盐环境采集B对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为唯对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基，并在高温条件下培养一碳源的培养基，并在高温条件下培养C获得图获得图A、B效果的接种方法分别是平板划线法、涂布平效果的接种方法分别是平板
23、划线法、涂布平板法板法D配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行pH调整调整答案答案C【训练训练3】(2012北京理综，北京理综，5)高高中生物学实验中，在接种时不进行中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是()。A将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中B将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上C将转基因植物叶片接种到无菌培养基上将转基因植物叶片接种到无菌培养基上D将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养
24、基上解析解析本题主要考查几种常见生物学实验对无菌操作的要求。本题主要考查几种常见生物学实验对无菌操作的要求。生产果酒和腐乳时对无菌的要求不是很高，接种不需要进行生产果酒和腐乳时对无菌的要求不是很高，接种不需要进行严格的无菌操作；土壤浸出液中含有多种杂菌，所以利用选严格的无菌操作；土壤浸出液中含有多种杂菌，所以利用选择培养基筛选土壤浸出液中特定微生物时，不进行严格无菌择培养基筛选土壤浸出液中特定微生物时，不进行严格无菌操作也不会影响实验结果；植物组织培养技术成功的关键是操作也不会影响实验结果；植物组织培养技术成功的关键是无菌条件，若接种时不进行严格无菌操作将可能导致实验失无菌条件，若接种时不进行
25、严格无菌操作将可能导致实验失败，故败，故C项符合题意。项符合题意。答案答案C分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 高考地位：高考地位：5年年6考考(2012浙江自选浙江自选17，2010重庆理重庆理综卷综卷)【典例典例2】(2012浙江自选，浙江自选，17)幽幽门螺杆菌门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答下列有关问题。请回答下列有关问题。(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，
26、这是因为在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有含有_，它能以尿素作为氮源；若有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周，则菌落周围会出现围会出现_色环带。色环带。(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。灭菌。A高压蒸汽高压蒸汽 B紫外灯照射紫外灯照射C体积分数为体积分数为70%酒精浸泡酒精浸泡 D过滤过滤(3)步骤步骤X表示表示_。在无菌条件下操作时，先将菌液稀。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液释，然后将菌液_到培养基平面上。菌液稀释的目的到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得是为了获得_菌落。菌落。(4)在培养时，需将
27、培养皿倒置并放在在培养时，需将培养皿倒置并放在_中。若不倒置培中。若不倒置培养，将导致养，将导致_。(5)临床上用临床上用14C呼气试验检测人体是否感染呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理，其基本原理是是Hp能将能将14C标记的标记的_分解为分解为NH3和和14CO2。解析解析(1)幽门螺杆菌幽门螺杆菌(Hp)含有脲酶，能以尿素为氮源，在加入含有脲酶，能以尿素为氮源，在加入尿素和酚红指示剂的培养基中培养尿素和酚红指示剂的培养基中培养Hp，由于尿素经脲酶的降解，由于尿素经脲酶的降解可产生碱性的可产生碱性的NH3，NH3能使培养基中的酚红由红黄色变成红色，能使培养基中的酚红由红黄色变成红色，故
28、菌落周围会出现红色环带。故菌落周围会出现红色环带。(2)由于尿素加热会分解，对尿素由于尿素加热会分解，对尿素溶液进行灭菌最好用溶液进行灭菌最好用G6玻璃砂漏斗过滤。玻璃砂漏斗过滤。(3)微生物的分离和培微生物的分离和培养步骤是：配制培养基养步骤是：配制培养基灭菌、倒平板灭菌、倒平板接种接种培养。为获得单培养。为获得单菌落，接种操作前应先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平菌落，接种操作前应先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上即可。面上即可。(4)微生物培养时需将培养皿倒置并放在恒温培养箱微生物培养时需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，则无法形成单菌落。中，若不倒置培养，则无法
29、形成单菌落。(5)幽门螺杆菌能将幽门螺杆菌能将14C标记的尿素分解为标记的尿素分解为NH3和和14CO2，故临床上常用，故临床上常用14C呼气试验检测呼气试验检测人体内幽门螺杆菌的存在。人体内幽门螺杆菌的存在。答案答案(1)脲脲酶红酶红(2)D(3)接种涂布单接种涂布单(4)恒温培恒温培养箱无法形成单菌落养箱无法形成单菌落(5)尿素尿素微生物的分离、计数与鉴定是微生物技术领域的重点内容之微生物的分离、计数与鉴定是微生物技术领域的重点内容之一，广泛应用于食品加工，微生物污染测定等行业，具有重一，广泛应用于食品加工，微生物污染测定等行业，具有重要的实践价值，相关内容在近年高考中多有体现，应高度重要
30、的实践价值，相关内容在近年高考中多有体现，应高度重视。视。1比较选择培养基与鉴别培养基比较选择培养基与鉴别培养基种类种类制备方法制备方法原理原理用途用途举例举例选择培养选择培养基基培养基中培养基中加入某些加入某些化学物质化学物质依据某些微依据某些微生物对某些生物对某些物质或环境物质或环境条件的嗜好、条件的嗜好、抗性而设计抗性而设计从众多从众多微生物微生物中分离中分离所需的所需的微生物微生物加入青霉加入青霉素分离得素分离得到酵母菌到酵母菌和霉菌和霉菌鉴别鉴别培养培养基基培养基中加培养基中加入某种指示入某种指示剂或化学药剂或化学药品品依据微生物产生依据微生物产生的某种代谢产物的某种代谢产物与培养基
31、中的特与培养基中的特定试剂或化学药定试剂或化学药品反应，产生明品反应，产生明显的特征变化而显的特征变化而设计设计鉴别不鉴别不同种类同种类的微生的微生物物伊红伊红-美蓝美蓝培养基可培养基可以鉴别大以鉴别大肠杆菌肠杆菌2.分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物(1)分分离原理：离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成脲酶，土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。使用以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌使用以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖；并
32、抑制或阻止其他微生物的生长，从而分的生长和繁殖；并抑制或阻止其他微生物的生长，从而分离出目的菌。离出目的菌。(2)土样的获得：从有哺乳动物排泄物的地方取得。土样的获得：从有哺乳动物排泄物的地方取得。(3)实验步骤：实验步骤：尿素细菌分离尿素细菌分离“查漏补缺查漏补缺”(1)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。菌的筛选。(2)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红变红)，标志着存在，标志着
33、存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(3)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。小部分。(4)微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用微生物筛选过程中必要的两种对
34、照培养基及其作用 对照组对照组作用作用现象现象结论结论未接种培未接种培养基养基有无杂菌污有无杂菌污染的判断染的判断未接种的培养皿中未接种的培养皿中无菌落生长无菌落生长未被杂菌未被杂菌污染污染接种的接种的牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基选择培养基选择培养基筛选作用的筛选作用的确认确认牛肉膏培养基上的牛肉膏培养基上的菌落数大于选择培菌落数大于选择培养基上的数目养基上的数目选择培养选择培养基具有筛基具有筛选作用选作用关键一点关键一点即使使用了选择培养基，所得到的微生物也未必即使使用了选择培养基，所得到的微生物也未必全为全为“目标微生物目标微生物”，因此，常需对选择培养基中菌落作进，因此，常需对选
35、择培养基中菌落作进一步鉴定。一步鉴定。【训练训练4】(2013浙江宁波二模浙江宁波二模)请请回答微生物培养和分离的有关问题。回答微生物培养和分离的有关问题。(1)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行和培养皿进行_(填填“消毒消毒”或或“灭菌灭菌”)；操作者的；操作者的双手需要进行清洗和双手需要进行清洗和_(填填“消毒消毒”或或“灭菌灭菌”)。若。若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_(填填“消毒消毒”或或“灭菌灭菌”)处理后才能丢弃，以防止处理后才能
36、丢弃，以防止培养物的扩散。培养物的扩散。(2)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是对于固体培养基应采用的检测方法是_。(3)欲从土壤中分离出能利用尿素的细菌：以欲从土壤中分离出能利用尿素的细菌：以_为唯一为唯一氮源且加入了氮源且加入了_指示剂的培养基；用指示剂的培养基；用_法分离法分离细菌。若培养基平板上有菌落存活且颜色变细菌。若培养基平板上有菌落存活且颜色变_，则说，则说明分离成功。明分离成功。(4)分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培培养
37、基，其成分养基，其成分_。A前者含琼脂，后者不含琼脂和琼脂糖前者含琼脂，后者不含琼脂和琼脂糖B两者都含有琼脂两者都含有琼脂C前者含有琼脂糖，后者不含琼脂糖但含琼脂前者含有琼脂糖，后者不含琼脂糖但含琼脂D两者都不含琼脂和琼脂糖两者都不含琼脂和琼脂糖解析解析(1)微生物培养过程中，实验操作的空间、操作者的衣微生物培养过程中，实验操作的空间、操作者的衣着和手等通常进行消毒，而微生物的培养器皿、接种用具和着和手等通常进行消毒，而微生物的培养器皿、接种用具和培养基等则需要进行灭菌。培养基等则需要进行灭菌。(2)检测培养基是否被污染，只需检测培养基是否被污染，只需将培养基在适宜温度下放置一段时间，观察培养
38、基上是否有将培养基在适宜温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生就行。菌落产生就行。(3)分离能利用尿素的细菌，只需以尿素为唯分离能利用尿素的细菌，只需以尿素为唯一氮源，加酚红作指示剂，采用涂布分离法分离细菌，只要一氮源，加酚红作指示剂，采用涂布分离法分离细菌，只要培养基中的指示剂变红，标志着存在脲酶水解尿素的作用，培养基中的指示剂变红，标志着存在脲酶水解尿素的作用，证明菌株可以以尿素为氮源。证明菌株可以以尿素为氮源。(4)分离以尿素为氮源的细菌所分离以尿素为氮源的细菌所用培养基应含有琼脂糖，而分离大肠杆菌所用培养基则不含用培养基应含有琼脂糖，而分离大肠杆菌所用培养基则不含琼脂糖而含琼脂
39、。琼脂糖而含琼脂。答案答案(1)灭灭菌菌(2)消毒消毒(3)灭菌灭菌(2)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生培养基上是否有菌落产生(3)尿素酚红涂布分离尿素酚红涂布分离(或涂布或涂布)红红(4)C易混点混淆易混点混淆“消毒消毒”与与“灭菌灭菌”点拨点拨区分消毒与灭菌区分消毒与灭菌规避规避1个易混点和个易混点和1个易错点个易错点项目项目消毒消毒灭菌灭菌条件条件使用较为温和的理化方使用较为温和的理化方法法使用强烈的理化因使用强烈的理化因素素结果结果杀死物体表面或内部一杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生部分
40、对人体有害的微生物物(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)杀死物体内外所有杀死物体内外所有的微生物、包括芽的微生物、包括芽孢和孢子孢和孢子适用适用实验操作的空间、操作者的实验操作的空间、操作者的衣着和手衣着和手微生物的培养器皿、微生物的培养器皿、接种用具和培养基等接种用具和培养基等常常用用方方法法煮沸消毒法煮沸消毒法(如如100，56 min)，巴氏消毒法，巴氏消毒法(80，15 min)，酒精、氯气、石，酒精、氯气、石炭酸等化学药剂消毒法炭酸等化学药剂消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌注：实验室培养微生物的过程中，常用灼烧灭菌法对接种环、注：实验室培养微生物
41、的过程中，常用灼烧灭菌法对接种环、接种针、试管口、瓶口等进行灭菌；用高压蒸汽灭菌法对培接种针、试管口、瓶口等进行灭菌；用高压蒸汽灭菌法对培养基、试管等进行灭菌；用干热灭菌法对玻璃器皿养基、试管等进行灭菌；用干热灭菌法对玻璃器皿(吸管、吸管、培养皿培养皿)和金属用具等进行灭菌。实验操作应在酒精灯火焰和金属用具等进行灭菌。实验操作应在酒精灯火焰旁进行，因为酒精灯火焰旁可形成一个无菌环境，可防止微旁进行，因为酒精灯火焰旁可形成一个无菌环境，可防止微生物的污染。生物的污染。易错点不明确划线分离法中每次灼烧接种环的目的易错点不明确划线分离法中每次灼烧接种环的目的点拨点拨划线分离操作中的相关问题归纳划线分
42、离操作中的相关问题归纳(1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束后，仍然需要灼烧接种环。线操作结束后，仍然需要灼烧接种环。(2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。环温度太高，杀死菌种。第一次灼烧第一次灼烧每次划线之前灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧划线结束灼烧目目的的避免接种环上可避免接种环上可能存在的微生物能存在的微生物污染培养物污染培养物杀死上次划线结束杀死上次划线结束后接种环上残留的后接种环上残留的菌种菌种杀死接种环上残杀死接种
43、环上残留的菌种，避免留的菌种，避免细菌污染环境或细菌污染环境或感染操作者感染操作者纠错演练纠错演练1(2013苏北八校联考苏北八校联考)微微生物培养过程中，要十分重视无菌生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作中错误的是防止杂菌污染，请分析下列操作中错误的是()。煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢接种操作要在酒精灯火焰附近进行无菌繁殖脱毒苗接种操作要在酒精灯火焰附近进行无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒家庭制作葡萄酒时要将
44、时，植物的外植体要进行消毒家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌培养基要进行高压蒸汽灭菌容器和葡萄进行灭菌培养基要进行高压蒸汽灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌ABCD解析解析无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂基、添加剂(指示剂或染色剂指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，养细胞和一部分芽孢，属于消毒；
45、为防止空气中杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故操作错误。高压蒸汽灭菌。故操作错误。答案答案D2如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为12345。下。下列操作方法正确的是列操作方法正确的是()。A只需操作前将接种环放在火焰旁灼烧灭菌即可只需操作前将接种环放在火焰旁灼烧灭菌即可B划线操作需在火焰上进行划线操作需在火焰上进行C在在5区域中才可以得到所需菌落区域中
46、才可以得到所需菌落D在在12345区域中画线前后都要对区域中画线前后都要对接种环灭菌接种环灭菌解析解析操作的前后都要对接种环进行灭菌。划线操作需在火操作的前后都要对接种环进行灭菌。划线操作需在火焰旁进行，而不是在火焰上；所有的划线区都有可能得到所焰旁进行，而不是在火焰上；所有的划线区都有可能得到所需菌落，只是需菌落，只是5区得到的菌落相对较纯。区得到的菌落相对较纯。答案答案D1(2011新课标全国卷新课标全国卷)有有些细菌可分解原油，从而消除由些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌
47、株。回答问题。壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题。(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于于_培养基。培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即两种，即_和和_。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力分解圈大说明该菌株的降解能力_。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用
48、的灭菌方通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、法有灼烧灭菌、_和和_。无菌技术要求实验操。无菌技术要求实验操作应在酒精灯作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。的污染。解析解析(1)欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。能生存，这类培养基属于选择培养基。(2)分离纯化菌种时，分离纯化菌种时，常采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，使
49、聚集常采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。单个的菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。在菌落周围形成的分解圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌灼烧灭菌(如接种环如接种环)、干热灭菌、干热灭菌(如培养皿如培养皿)和高压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌(如培养基如培养基)等。无菌技术要求在整个实验过程中操作都在酒等。无菌技术要求在整个实验过程中操作都在酒精灯火焰附近进行
50、，以避免周围微生物的污染。精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。答案答案(1)原原油选择油选择(2)平板划线法稀释涂布平板法平板划线法稀释涂布平板法(3)强强(4)干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰2(2010重庆高考重庆高考)炭炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可细菌培
