1、表观遗传学Epigenetics 蛋白质磷酸化n克隆动物未老先衰n同卵双生的双胞胎虽然具有相同的DNA序列，却存在表型的差异和疾病易感性的差异n组织特异性基因的表达n复杂疾病的发生n单从DNA序列上寻找众多疾病的病因是片面的，往往事倍功半，对于某些疾病甚至可能永远找不到答案。n随着对实验动物特别是克隆动物生物学性状的了解以及人们对众多疾病的深入研究，科学家发现，除了基因组DNA外，还有基因组之外的大量遗传学信息调控着基因的表达，表观遗传学(epigenetics)应运而生。n表观遗传是指在没有DNA序列变化的基础上，基因表达状态的可遗传性的改变。n表观遗传学是研究基因组DNA序列未发生变化、而
2、基因表达及基因功能的诱导和维持却发生可遗传变化的科学。n表观遗传学的研究已成为基因组测序后的人类基因组重大研究方向之一。这一飞速发展的科学领域从分子水平揭示了复杂的生物学现象，为解开人类和其他生物的生命奥秘、造福人类健康带来了新希望。n从现在的研究情况来看，表观遗传学变化主要集中在三大方面：nDNA甲基化修饰n组蛋白修饰n非编码RNA的调控作用。DNA甲基化与基因表达甲基化与基因表达 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化nDNA甲基化是指在甲基化酶的作用下，将一个甲基添加在DNA分子
3、的碱基上。nDNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态。nDNA甲基化的部位通常在CpG岛的胞嘧啶胞嘧啶甲基胞嘧啶甲基化反应化反应 DNMT1S-腺苷腺苷甲硫氨甲硫氨酸酸SAM胞嘧啶胞嘧啶5-5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶 真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型（mainte-nance）甲基转移酶，另一种是 从头合成（denovo synthesis）甲基转移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶
4、两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。n在结构基因的调控区段，CpG二联核苷常常以成簇串联的形式排列。结构基因5端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)。nCpG岛是CG二核苷酸含量大于50%的区域。CpG岛通常分布在基因的启动子区域。nCpG岛的甲基化会稳定核小体之间的紧密结合而抑制基因的表达。n当一个基因的启动子序列中的CpG岛被甲基化以后，尽管基因序列没有发生改变，但基因不能启动转录，也就不能发挥功能，导致生物表型的改变。nDNA甲基化抑制基因表达nDNA甲基化模式可以在DNA复制后被保持下来n肿瘤细胞
5、的甲基化特点n总体甲基化水平低n局部甲基化水平高，即抑癌基因的甲基化水平高n基因组印记与DNA甲基化密切相关1956年Prader-Willi综合征(Prader-Willi Syndrome,PWS)，患者肥胖、矮小、中度智力低下。染色体核型分析表明为 父源染色体15q11-13区段缺失。n1968年Angelman综合征(Angelman Syndrome，AS)，共济失调、智力低下和失语。母源染色体15q11-13区段缺失nPWS和AS综合症表明，父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，这种现象称为基因组印迹(genomic imprinting)。n有些基因的功能受到双亲基因组的
6、影响，即来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，打上了来源基因组的印记，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性。n涉及到不同亲本来源的印迹基因的DNA甲基化型都是在生殖细胞成熟过程中建立的。印迹基因的印迹基因的DNADNA甲基化型在生殖细胞成熟过程中的建立甲基化型在生殖细胞成熟过程中的建立原始性细胞原始性细胞（2n）合子合子（2n）配子配子（n）n迄今已发现的印迹基因已有150余个，大多成簇排列，其中许多是疾病基因。虽多数印迹基因的作用机制尚不清楚，然而几乎都与DNA甲基化型的异常相关联。Cover LegendJust as the discovery of th
7、e Rosetta Stone in 1799 by Napoleons troops enabled Egytian hieroglyphics to be deciphered,mathematical bioinformatic techniques have allowed the imprint status of a gene to be predicted from cis-acting genomic motifs.This resulted in the genome-wide identification of genes in the human with high pr
8、obability of being imprinted,and permitted the identification of candidate imprinted genes for complex human disorders where parent-of-origin inheritance is involved.Cover design by James V.Jirtle(Webwiz Design)组蛋白修饰n基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于低甲基化状态外，还需要具备另外一个表观遗传学条件，即组蛋白修饰处于激活状态。n组蛋白对特定氨基酸的修饰可以间接提供
9、某些蛋白的识别信息，然后通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结构，从而调控基因的表达。n组成核小体的组蛋白可以被多种化合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。n组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联；而组蛋白的甲基化则与浓缩的异染色质(hetero-chromatin)和表达受抑的基因相关联。n组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。n组蛋白修饰主要是氨基端的甲基化修饰和(或)乙酰化修饰，特定组蛋白
10、的氨基酸残基被甲基化和(或)乙酰化可以最终激活基因的表达，反之则抑制基因的表达。n特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。n目前研究还发现组蛋白修饰与CpG岛的甲基化密切相关。Histone Coden染色质蛋白并非只是一种包装蛋白，而是在DNA和细胞其他组分之间构筑了一个动态的功能平台。非编码RNA调节n无论是DNA修饰还是组蛋白修饰，都是基因活性调节的中间参与者，而真正诱导基因活性改变的最大可能者是功能性非编码RNA。n非编码RNA在调节基因表达、基因转录、调整染色质结构、表观遗传记忆、RNA选择性剪接以及蛋白质翻译中都发挥重要作用。n不仅如此，RNA在保
11、护机体免受外来核酸的侵扰中也扮演着重要的角色，被认为是最古老的免疫体系。n非编码RNA可依据大小分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，前者在基因簇以至整个染色体水平发挥顺式调节作用，甚至可以介导单条染色体的失活，后者主要是在转录后水平对基因的表达进行调控。Linking genome to proteomeClassification of RNATypesfunctionribosomal RNA(rRNA)messenger RNA(mRNA)transfer RNA(tRNA)heterogeneous nuclear RNA(hnRNA)small nuclear RNA(snRNA
12、)small nucleolar RNA(snoRNA)small cytoplasmic RNAribozymemicroRNA(miRNA)small interfering RNA(siRNA)non-coding RNA(ncRNA)component of ribosometemplate of protein synthesistransfer amino acidpremature mRNAparticipate the splicing and transfer of hnRNA,includes spliceosomal RNAprocess and modify rRNAr
13、ecognize the protein sorting signalcatalytic RNAusually endogenous,induce degradation of targeted mRNA usually exogenous,induce degradation of targeted mRNAall RNA other than mRNA,priorly functional RNA longer than 200nt基因表达的重新编程n已完全分化的细胞，其基因组在特定条件下经历表观遗传修饰重建而为胚胎发育中的基因表达重新编程(reprogramming)并赋予发育全能性，为
14、胚胎发育和分化发出正确的指令。n胚胎发育中表观基因组重新编程的差误将会导致多种表观遗传缺陷性疾病。原始性细胞原始性细胞成熟性细胞成熟性细胞胚胎组织胚胎组织受受精精卵卵表 观 基 因 组表 观 基 因 组个体发育过程中表观基因组的重编程个体发育过程中表观基因组的重编程早期原始生殖细胞在沿着生殖系统管腔移行时，原属体细胞型的表观遗传修饰早期原始生殖细胞在沿着生殖系统管腔移行时，原属体细胞型的表观遗传修饰(包括基因组印迹包括基因组印迹)会会被删除。在生殖细胞发生与成熟过程中表观遗传标记重新建立被删除。在生殖细胞发生与成熟过程中表观遗传标记重新建立(蓝线表示精子分化，红线表示卵细蓝线表示精子分化，红线
15、表示卵细胞分化胞分化)。受精后会进行除印迹基因。受精后会进行除印迹基因(由黑色虚线表示由黑色虚线表示)以外的表观遗传修饰的删除与重建，重建后以外的表观遗传修饰的删除与重建，重建后的表观基因组在组织特异性定型后被稳定地维持。的表观基因组在组织特异性定型后被稳定地维持。n诱导性多能干细胞 induced pluripotent stem cells,iPSnDNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA均参与基因表达重新编程的过程中。n真核细胞中存在着一个由RNA干扰、组蛋白结构修饰和DNA甲基化系统组成的一个表观遗传修饰网络，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。机体的表观遗传模式的变化在整个
16、发育过程中是高度有序的，也是严格受控的。蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化与非磷酸化蛋白质磷酸化与非磷酸化 非活性蛋白与活性蛋白的构象之间的转换是通过可逆共价修饰调节蛋白质的方式，蛋白激酶则是这一过程催化磷酸化的重要蛋白，而磷酸酯酶是去磷酸化的重要蛋白.已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸.根据是否有调节物来分又可分成两大类：根据是否有调节物来分又可分成两大类：信使依赖性蛋白质激酶信使依赖性蛋白质
17、激酶（messenger-dependent protein messenger-dependent protein kinasekinase），），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。蛋白激酶的催化作用：蛋白激酶的催化作用：使调节酶磷酸化 (1)磷酸化酶激酶P激活 (2)糖原合成酶P失活 使许多蛋白质磷酸化 (1)核中组蛋白磷酸化加速核酸的复制，转录。(2)核糖体蛋白质磷酸化加速蛋白质合成通性。(3)使膜蛋白磷酸化加速物质的转运。
18、蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用(1).在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于 胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速更迅速的反应。(3).对外界信号具有级联放大级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应持续反应。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸
19、。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。1、Ser/Thr蛋白激酶 蛋白磷酸化是蛋白激酶将磷酸基因转移到特定底物蛋白上的共价修饰过程，调控蛋白质的酶学活性或生物学功能。分为:cAMP依赖的PK Ca2+/磷脂依赖的PK Ca2+/（CaM）钙调蛋白依赖的PK cGMP依赖的PK 近年发现新成员DNA依赖的PKcAMP依赖的蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase.APK）cAMP-依赖蛋白激酶是一种四聚蛋白酶，含有两个调控亚基和两个催化亚基。当cAMP-依赖蛋白激酶的调控亚基结合时，激酶解离成两个具有催化活性的蛋白激酶（由催化亚基形成）和一个二聚的调控亚基。cAMP-依
20、赖蛋白激酶被活化后，它解离出来的活性蛋白酶能够催化ATP分子与目标代谢酶分子的磷酸化反应。一般是代谢酶的Ser或Thr残基的羟基被ATP磷酸化，其结果是代谢酶被抑制或激活。磷酸化代谢酶可在蛋白磷酸酶作用下去磷酸化而激活或失活。cAMP即是通过上述机制实现对代谢酶活性的调控。结构与功能n2个调节亚基（R）+2个催化亚基（C）APK全酶复合体（R2C2）（无cAMP时，无活性）ncAMP与特异R亚基结合构象变化 R亚基二聚体+2个有活性C亚基,各种哺乳动物细胞于不同水平表达3种C亚基亚型(CCC)和4种R亚基亚型(R R R R)结合成全酶APK 型和 型.不同R亚基亚型主要区别:RMg2+/AT
21、P高亲和位点 R自身磷酸化 II、Ca2+/磷脂依赖的蛋白激酶（Ca2+/phospholipid dependent protein kinase）经第二信使Ca2+、甘油二酯DG或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的蛋白激酶称为Ca2+/PL-PK或PKC，是肌醇磷脂信号传导通路的关键环节。多种激活剂与质膜上特异受体结合磷脂酶C 肌醇磷脂（PIP2）水解 三磷酸肌醇（IP3）+甘油二酯（DAG）生物效应 蛋白磷酸化CaMPKCa2+胞内Ca2+池 一系列细胞蛋白磷酸化 PKC 磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的两个酶解 产物：肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）和二酰基
22、甘油（DAG）。C激酶（PKC）是依赖于Ca2+的蛋白质激酶。由于IP3所引起的细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和Ca2+的双重影响所激活。C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是后者大大提高了C激酶对于Ca2+的亲和力，从而使得C激酶能被生理水平的Ca2+离子所活化。C激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化结构域和一个调节结域。1、IP3IP3作用作用：IP3与IP3受结合后，变构，钙通道打开，贮于内质网的Ca2+释放入细胞质内，使胞质Ca2+浓度升高，引起一系列效应。如:平滑肌收缩等.2、DAGDAG作用作用：激活蛋白激酶C,将存在
23、于靶蛋白质中得丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，改变靶蛋白质的活性。如:糖原合成酶磷酸化后，停止合成糖原。3 3、DAGDAG与与IP3IP3的协调作用的协调作用IP3 细胞质中Ca2+糖原合成酶活性蛋白激酶C 使IP3 诱导增高糖原磷酸化酶活性的过程终止。4 4、DAGDAG的激活机理的激活机理 DAG 增加蛋白激酶C对Ca2+的亲合性在Ca2+生理水平上被活化。蛋白激酶C为 77kd,催化区抑制调节区,当DAG结合到蛋白激酶C上，解除酶的调节区的抑制作用，使酶发挥催化活性。III、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶钙调蛋白依赖的蛋白激酶 CaM（钙调蛋白）作为细胞内Ca2+受体，由148个氨基酸碱基
24、组成的可溶性球蛋白 结构特点：（1）30%的酸性氨基酸，过量羧基提供了Ca2+可逆性结合的基团。（2）不含能使肽链定型的成分，即易氧化的半胱氨酸和羟脯氨酸，因而CaM具有高度灵活的，可与机体蛋白相互作用的三级结构。概念：CaM对第二信使Ca2+起反应所激活的蛋白激酶成为多功能的Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶（Ca2+Calmodumin dependent protein kinase，CaM-PK）1978年schulman 首次在突触体膜上发现了II型CaM-PK（CaM-K)研究发现 当Ca（二价正离子）结合到E螺旋区和F螺旋区之间的泡区时，引起每个螺旋在它的轴线附近旋转并改变其所在的
25、位置 使CaM转变成为一种对靶蛋白质具很高亲和性的构象 CaM只有在结合Ca（二价正离子）形成CaMCa（二价正离子）复合物才具生物活性。以两种方式调节代谢：a.直接与靶酶作用；b.活化依赖于CaMCa（二价正离子）的蛋白激酶IVIV、cGMPcGMP依赖的蛋白激酶依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase,GPK(cGMP dependent protein kinase,GPK)Ashman Ashman 等等19631963年从肾脏首次发现年从肾脏首次发现cGMPcGMPV V、DNADNA依赖的蛋白激酶依赖的蛋白激酶(DNA dependent pro
26、tein kinase,DNA(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)-PK)是一类存在于细胞核内，能被是一类存在于细胞核内，能被DNADNA激活的特异的激活的特异的Ser/ThrSer/Thr PK PK 引起引起多种核结合蛋白磷酸化。多种核结合蛋白磷酸化。第二类、第二类、酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体都拥
27、有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶(receptor protein tyrosine kinase,RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合的结构基础。跨膜结构区：是连接受体细胞内、外两部分，镶嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是由碱性氨基酸形成簇状结构。胞内活性区：保守性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸，可能是RPTK活性的功能的调节部位。第二部分为活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性。该区含有ATP结合位点和底物结合位点，可能是不同类型RPTK底物特异性的决定区域。第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具有高度的可塑性。
