1、特殊毒性及其试验特殊毒性及其试验 特殊毒性试验特殊毒性试验:致突变试验致突变试验 致畸试验致畸试验 致癌试验致癌试验 繁殖试验（生殖试验）繁殖试验（生殖试验）行为试验行为试验一、致突变试验一、致突变试验（一）细菌回复突变试验（一）细菌回复突变试验（Ames test）(1)原理 试验菌种试验菌种 野生型野生型 突变型突变型 鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌 his+his-在缺乏在缺乏his的培养基的培养基 能生长能生长 不能生长不能生长 主要是检查主要是检查引起遗传物质结构的改变及其引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验引起的性状变异的试验his-AA缺乏缺乏 Ames试验原理：野生型H
2、is+突变型突变型 His-正向突变回复突变物理化学等因素处理物理化学等因素处理受受 试试 物物His-His-培养基培养基接种能生长有致突变性有致突变性不能生长无致突变性无致突变性+(2)使用菌株Ames 1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为：TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA1538;1983年改推荐用:TA97,检测移码;TA98,检测碱基置换;TA100,检测碱基置换及移码;TA102,检测碱基置换及移码。(3)试验方法 致突变试验分体内体外两种情况：体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外代谢活化系统)，此法称微粒体间介法微粒体间介法。体内试验：可检测直接及间接致
3、突变物，不必加S9 此法称宿主间介法宿主间介法。(4)关于突变类型 分为:基因突变和染色体畸变 1.基因突变(gene mutation)或称 点突变(point mutation):是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤 基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。包括：包括：碱基置换（碱基置换（base substitution）移码（移码（frame shift）大段损伤（大段损伤（Large deletion or insertion）碱基置换：某一碱基脱落或配对性能改变 DNA复制时碱基错配（mispairing)第二次DNA复制时按正常配对 遗传下去 *转换转换(transitio
4、n)：A G C T *颠换颠换(transversion):):A T G C 无论转换或是颠换都只涉及一对碱基无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称故称。*后果：三联密码子的改变，可能出现同义密码，错义密码或终止密码，从而使基因表达 改变。移码 是DNA中增加或减少一对或几对不等于不等于3的倍数的倍数 的碱基改变所造成的突变。这种突变可造成整个DNA或一个基因阅读框架的 改变。后果：移码易造成致死性突变；大段损伤 是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt。*小缺失（小缺失（small deletion):):缺失的Nt 远远小于显微镜的观察能力。*插入（插入（insertion
5、):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。*转座子（转座子（trasposon):在质粒（plasimd)与质粒之间和质粒与染色 体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座（transposition)*后果：a.gene突变；b.产生新的gene c.染色体畸变；d.生物进化。2.染色体畸变 结构畸变 *裂隙和断裂裂隙和断裂(gap and break):仍保持线状连接者为裂隙,无线状连接者为断裂 *无着丝粒断片和缺失无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)微核微核(micronucleus):无着丝粒断片。微小体（微小体（minu
6、te body):小于染色体宽度的无着丝粒断 片,常成双出现。*环状染色体环状染色体(ring chromosome)*倒位倒位(inversion):断片倒转180再重接。*插入和重复（插入和重复（insertion and duplication)*易位（易位（translocation)*染色体交换（染色体交换（chromatid exchange):指两条或多条染色单体断裂后变位重接。分为：内换（内换（intrachange):同一染色体内的染色单体交换 互换（互换（interchange):不同染色体间的染色单体交换 *姐妹染色单体交换（姐妹染色单体交换（sister chromat
7、id exchange,SCE):用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T，产生染色单体差示染 色，可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅，如某一染色体 在姐妹染色单体间发生了同源节段内换，同源节段染色一深 一浅，这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示)各有一互补链不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成出现差示染色出现差示染色断裂、重排断裂、重排同位节段互换同位节段互换染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙(gap)(gap)断裂断裂(break)(break)断片断片(fragment)(fragment)和缺失和缺失(deletion)(deletion)微小体
8、微小体(minute body)(minute body)无着丝点无着丝点环环环状染色环状染色体体 双着丝点染色双着丝点染色体体 倒位倒位(inversion)(inversion)易位易位(translocation)(translocation)插入插入(insertion)(insertion)和重复和重复(duplication)(duplication)辐射体辐射体 染色体数目异常 整倍性畸变：单、三、四、多倍体 数目畸变 非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条 或多多条或少多条 2n-1,2n-2,2n+1,2n+2,染色体数目畸变的原因：a.不分离；b.染色体丢失；c.染色体桥；d.
9、核内复制。(二二)精子畸形试验精子畸形试验 *常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。*精子畸形表现：无钩，香蕉形，无定形，胖头，双头,双尾，尾折叠等。*常与亚慢性毒性试验结合进行。（三）染色体畸变分析（三）染色体畸变分析 *常用骨髓细胞观察。*观察的内容有：染色体数目畸变：染色体数目畸变：正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42 犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64 兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42 人2n=46。染色体结构畸变：染色体结构畸变：裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体 *剂量设计及分组:最高剂量组:LD50的1/8-1/10;中间剂量组:最高剂量组的1/15;最低剂量组
10、:最高剂量组的1/20。（四）微核试验（四）微核试验 *微核：细胞核之外，与核染色性一致的颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，形似 杏仁状或圆形。*来源：染色体断裂而形成的无着丝粒断片。*意义：说明染色体的完整性发生了改变，或染 色体分离改变,表明受试物对遗传物质 产生了损伤。（五）分子生物学方法（五）分子生物学方法（PCR检测）检测）突变的不良后果 二、致畸试验（一）概念 主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。致畸作用包括：1.母体效应母体效应:受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。2.胚胎效应胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。3.出生前胎儿效应
11、出生前胎儿效应:出生胎儿出现外表或内脏畸形。4.出生后效应出生后效应:引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如,后天生长发育或生殖功能受影响。（二）剂量设计及分组 高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率10%;低剂量组：LD50的1/301/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。（三）观察内容 产前剖腹产，检查活胎，死胎，吸收胎，黄体数及 外形和内脏畸形情况。v胎仔检查 自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎
12、。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。（四）致畸结果分析 母体LD50 =最小致畸量 评价：致畸指数致畸指数100,为强致畸物。为强致畸物。=最大不致畸剂量/最大可能摄入量 评价：致畸危险指数致畸危险指数300,说明致畸危险性小；说明致畸危险性小；致畸危险指数致畸危险指数100300，为中等致畸危险性；，为中等致畸危险性；致畸危险指数致畸危险指数 0.7 潜在致癌物 0.3+0.7 暂时无法下结论 +0.3 非致癌物 关于关于a a+i i和和a a-i i的参数见表的参数见表试验方法原则试验方法原则v受试动物：受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔性成熟大鼠、小鼠或
13、家兔 v剂量分组剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组量组）和一个对照组v染毒途径染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径实际接触途径v动物数动物数:每组雌雄各每组雌雄各1616到到2020只，或雌只，或雌1616到到2020只，只，雄雄8 8到到1010只只 生殖毒性试验生殖毒性试验 试验方案试验方案:v三代两窝三代两窝（断奶或出生周）（断奶或出生周）给予受试物到周给予受试物到周 第一次交配第一次交配第二次交配第二次交配观察三个月，喂饲普通饲观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况料，观察其生长发
14、育情况 断乳后给予受试断乳后给予受试物到周物到周 观察三个月，喂饲普通饲观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况料，观察其生长发育情况 断乳后给予受试断乳后给予受试物到周物到周 两代一窝两代一窝(和一代一窝和一代一窝)生殖试验生殖试验 F F断奶，检查发育情况断奶，检查发育情况F F出生，每窝留只幼仔出生，每窝留只幼仔F F交配交配断奶，给予受试物断奶，给予受试物F F（每窝选留幼仔只，雌雄各半）（每窝选留幼仔只，雌雄各半）第第 周周雌雄交配雌雄交配出生第周给予受试物（出生第周给予受试物（F F）v观察指标观察指标：受孕率（）受孕率（）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况反映雌性动物
15、生育能力以及雌性动物受孕情况 正常分娩率（）正常分娩率（）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼仔出生存活率（）幼仔出生存活率（）:反映雌性动物分娩过程是否正常反映雌性动物分娩过程是否正常 幼仔哺育成活率（）幼仔哺育成活率（）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 除上述个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死除上述个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考%100(%)交配雌性动物数妊娠雌性动物数受孕率生殖毒性的评价生殖毒性
16、的评价 外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。殖毒性试验来进行。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育
17、成活率）以及断况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。奶后发育情况等。是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。的试验。生殖毒性的评价生殖毒性的评价 思考题思考题 1.1.急性毒性试验常用哪些试验方法。急性毒性试验常用哪些试验方法。2.2.改良改良karberkarber法的试验要求。法的试验要求。3.3.亚慢性毒性试验的主要目的是什么？亚慢性毒性试验的主要目的是什么？4.4.蓄积性毒性试验的概念。蓄积性毒性试验的概念。5.Ames5.Ames试验的原理。试验的原理。6.6.微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了什么？什么？7.7.试阐述致畸的母体效应和胚胎效应的区别。试阐述致畸的母体效应和胚胎效应的区别。生殖毒性的评定指标是什么？生殖毒性的评定指标是什么？
