1、第十二章 核酶第一节第一节 ribozyme第二节第二节 脱氧核酶脱氧核酶第一节第一节 ribozyme一、一、ribozyme的发现的发现二、二、ribozyme的概念的概念三、三、ribozyme的种类的种类四、四、ribozyme研究进展与展望研究进展与展望u20世纪世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的的T.Cech 在研究四膜虫在研究四膜虫 rRNA前体的剪接时发现，前体的剪接时发现，其其 26S RNA 具有自我催化活性，由此提出了核酶具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。的概念。u美国耶鲁大学的美国耶鲁大学的S.Altman在大肠杆菌
2、中发现了在大肠杆菌中发现了RNase P具有生物催化功能，从而改变了生物催比具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，剂的传统概念。为此，T.Cech和和S.Altman共同获得共同获得了了1989年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。一、一、ribozyme的发现的发现 四膜虫四膜虫26S rRNA前体内含子的二级结构以及内含子、外显子的剪接点前体内含子的二级结构以及内含子、外显子的剪接点 核酶的发现：核酶的发现：内含子的切除反应发生在含有核内含子的切除反应发生在含有核苷酸和纯化的苷酸和纯化的26S rRNA前体前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是而不含有任何蛋
3、白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。前体自身催化的，而不是蛋白质。核酶的证实：核酶的证实：将编码将编码26S rRNA前体前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成转录成26S rRNA前体分子。结果表明这种人工制备的前体分子。结果表明这种人工制备的26S rRNA前体分子在前体分子在没没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象为。这种现象为自我剪接自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发
4、现，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有催化化学反应的活性，二、二、ribozyme概念概念概念：概念：具有催化功能的具有催化功能的RNA分子分子，是，是生物催化剂生物催化剂。又称核酸类酶、酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶核酶类酶RNA。特点：特点：核酶的作用底物可以是不同的分子核酶的作用底物可以是不同的分子,或者作用或者作用 底物是同一底物是同一RNA分子中的某些部位。分子中的某些部位。与蛋白质酶相比：与蛋白质酶相比：核酶的催化效率较低，是一种较核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。核酶的功能：核
5、酶的功能：1.核苷酸转移作用。核苷酸转移作用。2.水解反应，即磷酸二酯酶作用。水解反应，即磷酸二酯酶作用。3.磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。4.脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。5.RNA内切反应，即内切反应，即RNA限制性内切酶作用。限制性内切酶作用。三、三、Ribozyme的种类的种类 根据作用方式分为：根据作用方式分为：p 剪切型（把剪切型（把RNA前体的多余部分切除），前体的多余部分切除），p 剪接型（把剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来）子部分连接起来）
6、根据所作用的底物不同分为根据所作用的底物不同分为：p 自体催化（催化分子内反应）自体催化（催化分子内反应）p 异体催化（催化分子间反应）异体催化（催化分子间反应）I型内含子:来源rRNA剪接型核酶 II型内含子:来源MT RNA 锤头核酶:来源植物病毒剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶：来源人类病毒 RNase P：来源tRNA的成熟 异体催化 根据核酶的结构和催化反应：根据核酶的结构和催化反应：p RNA和蛋白质复合物和蛋白质复合物：核糖核酸酶：核糖核酸酶P。p 小分子的小分子的RNA：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋白质参与
7、。这些白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底分子可以分为两个部分，一部分是底物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于独立的底物。工核酶去作用于独立的底物。p、型内含子：型内含子：将自身从前体将自身从前体mRNA中剪接出去的作用中剪接出去的作用共同点：共同点：都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物是是RNA，可以是，可以是RNA分子本身，也可以是别的分子本身，也可以是别的RNA分子。分子。几种能进行自我剪切的几种能进行自我剪切的RNA结构结构小分子核酶常见类型
8、：锤头、发夹、小分子核酶常见类型：锤头、发夹、HDV催化特点：产生催化特点：产生5-OH、2,3-环状磷酸基末端环状磷酸基末端I型内含子剪接，型内含子剪接，图中的图中的pG可以是可以是GTP、GDP或是或是GMP 特点：特点：I型需要游离的鸟苷或其磷酸化的衍生物的参与，剪接过程中，内含子先以型需要游离的鸟苷或其磷酸化的衍生物的参与，剪接过程中，内含子先以 线性形式被释放，然后再转变成一个片段和一个环状分子。线性形式被释放，然后再转变成一个片段和一个环状分子。型型内内含含子子剪剪接接 特点：特点：型内含子的切除要形成套索结构，以套索的形式释放内含子型内含子的切除要形成套索结构，以套索的形式释放内
9、含子 四、四、Ribozyme研究进展与展望研究进展与展望 对各种已知对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme。研究热点：研究热点：从催化分子内反应的自我剪切从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设设计出催化分子间反应的计出催化分子间反应的ribozyme。1、抗病毒方面的研究、抗病毒方面的研究uHIV是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。HIV主要
10、主要攻击攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低，导致淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低，导致死亡。死亡。uWong等等(1998)利用利用发卡型核酶发卡型核酶抑制抑制HIV-1 基因表达，在一期基因表达，在一期临床试验中，用带有发夹状核酶的载体临床试验中，用带有发夹状核酶的载体体外转染患者的体外转染患者的T细胞细胞,然后再将这些然后再将这些T 细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内 HIV-1 的滴度降低。的滴度降低。u在的二期临床试验中，在的二期临床试验中，Mit suyasu等等(2009)用用逆转录病毒载体逆转录病毒载体将抗
11、将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到感造血干细胞注入到感染染 HIV 的患者体内的患者体内，结果，结果38名患者携带了该种疗法所使用的完名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现整拷贝。研究结果发现,CCR5是是HIV-1 R5 毒株的重要细胞复毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在合受体之一，该受体在 HIV-1感染初期起重要的作用，但是它感染初期起重要的作用，但是它的缺失对宿主是无关的，因此的缺失对宿主是无关的，因此CCR5 可作为核酶切割的理想靶点。可作为核酶切割的理想靶点。HBV是一种逆转录病毒。其生活史如下：是一种逆转录病毒。其
12、生活史如下：HBV进入肝细胞进入肝细胞 在宿主酶作用下以负链在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正为模板合成正链链DNA 形成共价闭合环状形成共价闭合环状DNA 在宿主在宿主RNA聚合酶聚合酶 作用下合成作用下合成mRNA(亦称前基因组亦称前基因组RNA,pgRNA)在在HBV逆转录酶作用下合成负链逆转录酶作用下合成负链DNA 在在HBV DNA 聚合酶作用聚合酶作用下合成正链下合成正链DNA 形成子代闭合环状形成子代闭合环状DNA。u由于由于 HBV 的复制必须经过的复制必须经过RNA 的过程，所以可设计特异性核的过程，所以可设计特异性核酶用于切割酶用于切割 RNA，从而阻断，从而阻断HBV
13、 的复制过程。的复制过程。uFritz 等等(1992)合成了针对合成了针对HBV pgRNA 的的3个不同的核酶，个不同的核酶，直接作用于体外转录获得的直接作用于体外转录获得的 HBV 的的pgRNA，结果显示这，结果显示这3个核酶都能准确地切割底物个核酶都能准确地切割底物RNA，表明，表明HBV RNA易被核酶易被核酶切割。切割。u栾中华等栾中华等(2005)将将HDV 核酶基因序列核酶基因序列构建到原核载体构建到原核载体中中,并并转染细胞转染细胞,通过通过 ELISA检测和定量检测和定量PCR 测定载体的抑制效果，测定载体的抑制效果，筛选出了两种抑制效率高的筛选出了两种抑制效率高的 HB
14、V 核酶核酶,抑制率达抑制率达 68%。u王传玺等王传玺等(2007)将将 HBV核酶基因转入重组逆转录病毒载体核酶基因转入重组逆转录病毒载体pMSCV/U6 中，中，运用脂质体运用脂质体转染细胞，嘌呤霉素筛选稳定转染细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞株等方法，构建了重组逆转录病毒载体，在包装细胞系细胞株等方法，构建了重组逆转录病毒载体，在包装细胞系中能生产高滴度的逆转录病毒，有效抑制中能生产高滴度的逆转录病毒，有效抑制 HepG2215 细胞细胞内内HBV的复制。的复制。2、核酶的抗肿瘤作用、核酶的抗肿瘤作用针对多药耐药性基因设计核酶针对多药耐药性基因设计核酶u多药耐药性多药耐药性(mult idr
15、ug resistnce,MDR)是指是指肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤急需突破的一大难题。急需突破的一大难题。uHiroyuki(1993)设计一个特异性切割设计一个特异性切割MDR1 mRNA 序列的锤序列的锤头状核酶，在头状核酶，在体外对体外对 MDR1 mRNA进行切割进行切割，显示锤头状核，显示锤头状核酶能切割酶能切割MDR1 mRNA 且使且使MDR恢
16、复显性。恢复显性。uWang等等(2003)设计并合成一个抗设计并合成一个抗MDR1的锤头状核酶的锤头状核酶，由，由一个含有一个含有RNA 聚合酶聚合酶启动子的逆转录病毒载体将其输送到启动子的逆转录病毒载体将其输送到人肝癌细胞系人肝癌细胞系HepG2 中，结果显示转染了锤头状核酶的细胞中，结果显示转染了锤头状核酶的细胞对阿霉素敏感，并有对阿霉素敏感，并有MDR1表达量的降低。这说明无论用逆转表达量的降低。这说明无论用逆转录病毒载体还是用脂质体转染抗录病毒载体还是用脂质体转染抗 MDR1 的核酶都有可能有选的核酶都有可能有选择的适用于择的适用于MDR 的治疗。的治疗。uGao等等(2007)在体
17、外使重组核酶仅在乳腺癌细胞中表达，而在体外使重组核酶仅在乳腺癌细胞中表达，而在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍倍,对长春花碱的对长春花碱的抗药性降低抗药性降低32倍。倍。核酶展望核酶展望u核酶能切割致病基因的核酶能切割致病基因的mRNA，通过使其，通过使其mRNA 断裂来抑制断裂来抑制致病基因的翻译及表达，从而达到预防及治疗疾病的目的；致病基因的翻译及表达，从而达到预防及治疗疾病的目的；u核酶具有高度的特异性核酶具有高度的特异性,它只对能与其互补的它只
18、对能与其互补的mRNA 发挥切发挥切割作用，而对宿主细胞没有任何副作用，因此它是极安全的割作用，而对宿主细胞没有任何副作用，因此它是极安全的基因治疗工具。基因治疗工具。1、核酶的本质是、核酶的本质是RNA分子，极易被分子，极易被RNA 酶降解。如何能提酶降解。如何能提高核酶的稳定性？高核酶的稳定性？2、要使核酶发挥最佳的催化活性，必须解决时间和空间问题，、要使核酶发挥最佳的催化活性，必须解决时间和空间问题，既要使核酶在合适的时间表达，还要使核酶及其切割底物在既要使核酶在合适的时间表达，还要使核酶及其切割底物在细胞的某一特定空间相互作用。细胞的某一特定空间相互作用。3、核酶的催化作用还依赖于病毒
19、的滴度在病毒滴度低的时候、核酶的催化作用还依赖于病毒的滴度在病毒滴度低的时候其切割活性明显，病毒滴度较高时，其切割活性显著降低。其切割活性明显，病毒滴度较高时，其切割活性显著降低。？第二节第二节 脱氧核酶脱氧核酶 一、概念一、概念 利用体外分子进化技术合成的一种具有有高效的催化活利用体外分子进化技术合成的一种具有有高效的催化活性和结构识别能力的性和结构识别能力的单链单链DNA片段片段。同单链同单链RNA分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活性。未发现自然界中存在天然的脱氧核酶。性。未发现自然界中存在天然的脱氧核酶。u根据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为根据催
20、化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：大类：切割切割RNA的脱氧核酶、的脱氧核酶、切割切割DNA的脱氧核酶、的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。脱氧核酶分子的构建是通过扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能脱氧核酶分子的构建是通过扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子实现。的活性分子实现。1、建立具有多样性的、建立具有多样性的DNA分子库，其中的每一条分子两端的序列固定；分子库，其中的每一条分子两端的序列固定；2、利用针对这些序列的
21、、利用针对这些序列的PC R 引物进行扩增。设计引物时，使引物进行扩增。设计引物时，使PCR 产物的一条产物的一条链上链上 5-C端带上生物素端带上生物素,并插入一个三磷酸核苷，将这些嵌合分子通过并插入一个三磷酸核苷，将这些嵌合分子通过5-C端的端的生物素固定在固相载体上，给予一定的条件使其进行自我裂解；生物素固定在固相载体上，给予一定的条件使其进行自我裂解；3、具有裂解功能的分子链内裂解后、具有裂解功能的分子链内裂解后,从固相载体上脱离下来。再利用上述从固相载体上脱离下来。再利用上述PCR 引物进行下一轮的选择。直至所选出的分子的裂解活性达到一定水平；引物进行下一轮的选择。直至所选出的分子的裂解活性达到一定水平；4、将、将PCR 产物克隆产物克隆,测序。便得到具有自我裂解活性的测序。便得到具有自我裂解活性的DNA分子的序列。分子的序列。二、脱氧核酶的结构二、脱氧核酶的结构Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子。有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子。三、脱氧核酶的催化特性三、脱氧核酶的催化特性1、稳定性高、稳定性高2、催化作用高效、催化作用高效3、活性依赖金属离子、活性依赖金属离子4、特异性强、特异性强5、容易获得、容易获得
