1、实验一：实验一：大肠杆菌表达载体的构大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达建及融合蛋白诱导表达生命科学技术学院生命科学技术学院2010年年6月月黑曲霉的优化培养黑曲霉的优化培养总总DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR扩增扩增xynB基因基因目的基因的目的基因的TA克隆克隆质粒质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体pET-28(a)+酶连酶连酶连产物转化酶连产物转化E.coli DH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒挑取转化子并抽
2、提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证及酶切验证)28S18S重组表达质粒转化重组表达质粒转化E.coli BL21挑取重组子挑取重组子,用菌落用菌落PCR方法验证方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定-Bradford法法目标蛋白的鉴定目标蛋白的鉴定Western biotting融合蛋白诱导表达流程图融合蛋白诱导表达流程图XylBCK100mM IPTG1ml LB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37,O/N37,2.7h37,2.7h37,O/N
3、30,4 h28,4 h1ml LB+Kan3ul 150ul3ul 3ul 3ul 50ml LB+Kan IPTG 100mM 使用浓度使用浓度0.1mM Kan 100mg/ml 使用浓度使用浓度50g/ml PBS缓冲液：缓冲液：137mM NaCl 2.7mM KCl 10mM Na2HPO4 10mM KH2PO4 试剂及缓冲液：试剂及缓冲液：3SDS缓冲液：缓冲液：187.5mM Tris-HCl(pH6.8,25)6%w/v SDS 30%甘油甘油 0.03%w/v 溴酚蓝溴酚蓝Gel Staining Buffer(每每100ml):考马斯亮蓝考马斯亮蓝 250 mg 甲醇甲
4、醇 45 ml 乙酸乙酸 10 ml 水水 45 mlGel Destaining Buffer:甲醇甲醇 100 ml 乙酸乙酸 100 ml 加水至加水至 1000 mlSDS-PAGE胶：胶：30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 10%SDS 1.5M Tris-HCl pH8.8 0.5M Tris-HCl pH6.8 10%过硫酸铵（现配）过硫酸铵（现配）TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris 250mmol/L 甘氨酸（电泳级）（甘氨酸（电泳级）（PH8.3）0.1%SDS 可配成可配成5贮存液备用，在贮存液备用，在900ml去离子水中溶解去离子水中
5、溶解15.1gTris碱和碱和94g甘氨酸，然后加入甘氨酸，然后加入50ml 10%（w/v）的电泳级的电泳级SDA贮存液，用去离子水补至贮存液，用去离子水补至1000ml。操作步骤操作步骤1：（小规模诱导（小规模诱导-筛选正确表达克隆子）筛选正确表达克隆子）1、从平板上挑取、从平板上挑取1个个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有转化子接种于装有2ml LB/Kan（Kan浓度浓度50ug/ml）培养基的）培养基的PA瓶中，瓶中，37oC，250rpm，培养过夜；，培养过夜；2、取过夜培养物按、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有接种量分别转接二个装有2ml LB/Kan的的PA
6、瓶中，瓶中，37 培养约培养约2小时小时40分钟；分钟；3、培养结束后，分别向其中一个瓶加入、培养结束后，分别向其中一个瓶加入IPTG（终浓度（终浓度0.1mM）并标记为并标记为“+I”，另一瓶不加，另一瓶不加IPTG标记为标记为“-I”，28 培养，培养，250rpm，约，约4小时后收集菌体；小时后收集菌体；4、从、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有菌液于两个标有“+I”、“-I”的的1.5ml离心管中离心管中,离心收集菌体离心收集菌体,10000 rpm、RT、1分钟，分钟，去上清，加入去上清，加入80ul缓冲液和缓冲液和40ul 3SDS上样缓冲液悬浮菌
7、体，上样缓冲液悬浮菌体，-20保存备用。保存备用。5、取前面保存菌体（加入、取前面保存菌体（加入1SDS上样缓冲液），置沸水上样缓冲液），置沸水5分钟（破细胞），然后置室温；分钟（破细胞），然后置室温；6、在室温以、在室温以10000rpm离心离心1分钟，取上清分钟，取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。蛋白电泳检测。附：附：SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳：胶的制备及蛋白质电泳：12%分离胶配制分离胶配制(5ml):水水 1.6ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 2 ml1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.3ml10%SDS 0.05ml10%过硫酸铵过硫酸铵 0.05m
8、lTEMED 0.002 ml分离胶配制时，过硫酸铵和分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混，将胶液混合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。5%积层胶配制积层胶配制(2ml):水水 1.4ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 0.33 ml0.5M T
9、ris-HCl(pH6.8)0.25ml10%SDS 0.02ml10%过硫酸铵过硫酸铵 0.02mlTEMED 0.002 ml积层胶制作方法跟分离胶制作相似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入积层胶制作方法跟分离胶制作相似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入梳子，静置梳子，静置30分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒入板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒入Tris-甘氨酸电泳液，使其甘氨酸电泳液，使其没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。点样：所有的样品
10、和蛋白点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴点样前都要沸水浴5分钟使分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。点样完毕后即可开始电泳，先以点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑伏电压跑15-20分钟，蛋分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色染色30-45分钟。分
11、钟。染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，前染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，前面几次可以时间较短，第一次约面几次可以时间较短，第一次约10分钟，依次时间稍微延长，分钟，依次时间稍微延长，最后一次可以过夜脱色。最后一次可以过夜脱色。1、挑取、挑取1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有2ml LB/Kan（Kan浓度浓度50ug/ml）培养基的）培养基的PA瓶中，瓶中，37oC培养过夜；培养过夜；2、按、按1%接种量接种于接种量接种于50ml LB/Kan（Kan浓度浓度50ug/ml）中）中37 培养约培养约2小时小时40分钟，分
12、钟，OD600=0.4-0.6；（；（前两步与操作步前两步与操作步骤骤1相同相同）3、培养完毕后，向三角瓶中加入、培养完毕后，向三角瓶中加入IPTG（100mM）50l，使培，使培养液中养液中IPTG终浓度为终浓度为0.1mM；28 诱导培养，诱导培养，250rpm，约，约4小时后收集菌体；小时后收集菌体；4、吸菌液、吸菌液1ml于于1.5ml离心管中，另取离心管中，另取20ml倒入倒入50ml离心管中离心管中,离心收集菌体离心收集菌体,6000 rpm，4,10分钟去除培养基，加入分钟去除培养基，加入2ml 1PBS缓冲液悬浮菌体，然后分装于缓冲液悬浮菌体，然后分装于2个个1.5ml离心管中
13、，离心管中，10000rpm，离心，离心2分钟，去上清，分钟，去上清，-20保存备用。保存备用。操作步骤操作步骤2：（大规模诱导（大规模诱导-大量表达目标蛋白）大量表达目标蛋白）实验二：实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋大肠杆菌细胞破碎及蛋白浓度测定白浓度测定1、取出保存的诱导后的细胞（、取出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后，），在冰上缓慢融化后，加入加入1mlPBS缓冲液；缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开始超声，中，开始超声，10 sec/次，间歇次，间歇15 sec（避免过度产热），（避免过度产热
14、），重复数次（一般重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在次）直至溶液变清亮；所有过程均需在冰上进行；冰上进行；3、在、在4、13000rpm离心离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；4、取上清液于另一干净的、取上清液于另一干净的1.5ml离心管中，取离心管中，取40l上清液测上清液测定总蛋白的浓度。定总蛋白的浓度。采用采用BSA法测定蛋白浓度（法测定蛋白浓度（Bradford,1972），首先），首先作好标准曲线，然后将样品测得的作好标准曲线，然后将样品测得的OD在标准曲线上比较后在标准曲线上比较
15、后获得样品蛋白质浓度。获得样品蛋白质浓度。方法：方法：1、完全溶解、完全溶解BSA蛋白标准品蛋白标准品(5mg/ml)，用，用PBS将标准品稀释将标准品稀释成成100-500 g/ml的溶液的溶液2、分别取、分别取40L的不同浓度的溶液加入到的不同浓度的溶液加入到1mL考马斯亮蓝试考马斯亮蓝试剂中，摇匀，室温反应剂中，摇匀，室温反应3-5 min后，在后，在595 nm处测定光吸收处测定光吸收值。值。3、以光吸收值为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，绘制标、以光吸收值为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，绘制标准曲线。准曲线。蛋白浓度标准曲线的绘制蛋白浓度标准曲线的绘制 1、取出保存的诱导后的细胞（、取
16、出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后，），在冰上缓慢融化后，加入加入1mlPBS缓冲液；缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开始超声，中，开始超声，10 sec/次，间歇次，间歇15 sec（避免过度产热），（避免过度产热），重复数次（一般重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在冰次）直至溶液变清亮；所有过程均需在冰上进行；上进行；3、在、在4、13000rpm离心离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；实验三
17、：实验三：表达蛋白的纯化表达蛋白的纯化4、细胞破碎上清液中，加入、细胞破碎上清液中，加入Ni-NTA树脂柱，在树脂柱，在4下结合下结合1h，每，每5分钟摇动一次；然后分钟摇动一次；然后5000 r/min离心离心1 min移除上移除上清液；清液；5、加入、加入10 mmol/L咪唑咪唑(imidazole)，50 mmol/L pH7.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液(PBS buffer)，在，在4条件下洗涤条件下洗涤30min，弃上，弃上清；重复洗涤清；重复洗涤3次，保留次，保留Ni-NTA柱；柱；6、加入、加入250l 100 mmol/L咪唑咪唑(imidazole)、50 mmol/L pH7
18、.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液(PBS buffer)洗脱液，在洗脱液，在4条件下洗涤条件下洗涤30min后后5000 r/min离心离心1 min，用移液器小心收集上清，用移液器小心收集上清（应尽量避免吸到离心管底部的（应尽量避免吸到离心管底部的Ni-NTA柱），置于新的柱），置于新的1.5ml离心管中，离心管中，-20贮存备用。贮存备用。实验四：实验四：表达蛋白的鉴定表达蛋白的鉴定-western杂交杂交操作步骤操作步骤1 蛋白质电泳蛋白质电泳 取取-20保存的纯化好的蛋白样品（洗脱收集的上清）保存的纯化好的蛋白样品（洗脱收集的上清）50l，用，用PBS十倍稀释；取十倍稀释；取50l稀释液，加入
19、稀释液，加入25l 3SDS上样缓冲液，沸水水浴上样缓冲液，沸水水浴5分钟；分钟；领取一管（每块胶）领取一管（每块胶）GST蛋白样品作为阴性对照蛋白样品作为阴性对照 领取一管（每块胶）领取一管（每块胶）xylB蛋白样品作为阳性对照蛋白样品作为阳性对照 各样品在室温以各样品在室温以10000rpm离心离心1分钟，取上清分钟，取上清10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳。蛋白电泳。操作步骤操作步骤2 2 蛋白质的半干式电转移蛋白质的半干式电转移（戴手套操作）（戴手套操作）将蛋白胶的积层胶切除将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时，不含目当胶上的样品较少时，不含目的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块
20、尽可能小的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小)，然后，然后浸入浸入Towbin buffer中平衡；中平衡；预先准备专用的滤片预先准备专用的滤片2张张(或或18张滤纸张滤纸)和和1张硝酸纤维张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜一角做好标记；一角做好标记；将将 1张滤片张滤片(或或9张滤纸张滤纸)在在Towbin buffer中浸润后放中浸润后放置在电极上置在电极上(如用如用9张滤纸则应逐张叠放整齐张滤纸则应逐张叠放整齐)，用玻璃，用玻璃棒挤出所有气泡。（棒挤出所有气泡。（具体摆放顺序见下图具体摆放顺序见下图）于于Towbin
21、 buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片片上，排出气泡；上，排出气泡；然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡；然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡；再依次将另外再依次将另外9张滤纸张滤纸(1张滤片张滤片)在在Towbin buffer中浸润后放中浸润后放置在蛋白胶上。置在蛋白胶上。加上阴极电板，加上阴极电板，25V电压转移电压转移40分钟。分钟。转移完成后，取出转移完成后，取出NC膜，在膜，在TBS漂洗漂洗5min，置入丽春红染，置入丽春红染液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗1mi
22、n，用铅笔标，用铅笔标记处蛋白质记处蛋白质Marker的位置，然后加入的位置，然后加入TBS漂洗至颜色消失；漂洗至颜色消失；9层滤纸电转缓冲液层滤纸电转缓冲液9层滤纸电转缓冲液层滤纸电转缓冲液阳极阳极(+)(+)阴极阴极(-)(-)Trans-Blot SD with Gel Sandwich 操作步骤操作步骤3 3 膜的封闭膜的封闭 用含有用含有5脱脂牛奶的脱脂牛奶的TBS-T封闭封闭NC膜（含有膜（含有0.1%吐温吐温20的的1倍的倍的TBS），在室温条件下孵），在室温条件下孵育育1至至2小时小时(推荐在推荐在4条件下孵育过夜条件下孵育过夜)；用用TBS-T漂洗：漂洗：15分钟，分钟，1次
23、；次；5分钟，分钟，2次。次。在室温条件下，将在室温条件下，将NC膜转入含有膜转入含有1脱脂牛奶和合脱脂牛奶和合适稀释度的一抗的适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（溶液中（1:1000），孵育），孵育1至至2小时；小时；用用TBS-T漂洗：漂洗：15分钟，分钟，1次；次；5分钟，分钟，2次。次。操作步骤操作步骤4 一抗杂交一抗杂交操作步骤操作步骤5 5 二抗进行杂交二抗进行杂交 在室温条件下，将在室温条件下，将NC膜转入含有膜转入含有1脱脂牛奶脱脂牛奶和合适稀释度的二抗的和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中溶液中(1:5000)，孵育孵育1小时；小时；用用TBS-T漂洗：漂洗：15分钟，分钟，1
24、次；次；5分钟，分钟，3次。次。用用TBS漂洗：漂洗：5分钟，分钟，3次次操作步骤操作步骤6 DAB（3,3二氨基联苯二胺）显色检测二氨基联苯二胺）显色检测加适量显色液至将膜浸没，观察，出现清晰的条加适量显色液至将膜浸没，观察，出现清晰的条带（最多带（最多5分钟）即可加入蒸馏水终止反应。分钟）即可加入蒸馏水终止反应。Towbin Buffer：25mM Tris pH8.3 192mM glycine 20%methanol 10TBS缓冲溶液（缓冲溶液（1L）Tris-Base 24.2g，NaCl 80g，pH7.6显色液显色液(10ml)：DAB 6mg 0.01 M Tris-HCl(
25、pH7.6)9ml 0.3%CoCl2 1ml 30%H2O2 10ul 缓冲液配方：缓冲液配方：第一组，第二组，第三组，第四组第一组，第二组，第三组，第四组 配配YPD液体培养基液体培养基3L 葡萄糖葡萄糖 20g，酵母提取物，酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨20g，pH6.5定容至定容至1L 分装分装20ml/250ml三角瓶，三角瓶，75瓶瓶 200 ml/500ml三角瓶，三角瓶，7瓶瓶第五组，第六组，第七组，第八组第五组，第六组，第七组，第八组 配配BMMY液体培养基液体培养基4L 酵母提取物酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨20g，酵母氮碱，酵母氮碱3.4g，硫酸铵，硫酸铵
26、10g，用用pH7.0的的0.1M的磷酸钾缓冲液定容至的磷酸钾缓冲液定容至1L。（pH7.0 0.1mol/L磷酸钾缓冲液：磷酸钾缓冲液：1mol/L K2HPO4 61.5ml，1mol/L KH2PO4 38.5ml，定容至，定容至1L，调节，调节pH，定容至，定容至1L）分装分装50ml/250ml三角瓶，三角瓶，75瓶瓶第九组，第十组，第十一组第九组，第十组，第十一组 PA瓶瓶100个，个，50ml离心管离心管100个，洗好包好，灭菌个，洗好包好，灭菌 250ml三角瓶三角瓶200个洗好个洗好 500ml三角瓶三角瓶50个，试剂瓶个，试剂瓶20个洗好个洗好 第十二组，第十三组，第十四组
27、第十二组，第十三组，第十四组 配配LB液体培养基液体培养基 6L 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g，酵母提取物，酵母提取物 5g，NaCl 10g，pH7.0定容至定容至1L 分装分装50ml/250ml三角瓶，三角瓶，40瓶瓶 200 ml/500ml三角瓶，三角瓶，20瓶瓶 第十五组第十五组配置配置10%SDS（w/v）500 mlTris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液:配成配成5贮存液备用，在贮存液备用，在900ml去离子水中溶解去离子水中溶解 15.1gTris碱和碱和94g甘氨酸，甘氨酸，然后加入然后加入50ml 10%（w/v）的电泳级）的电泳级SDS贮存液，贮存液，用去离子水补至用去
28、离子水补至1000ml。染色液染色液Gel Staining Buffer 1L 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 2.5 g，甲醇，甲醇 450 ml，乙酸，乙酸100 ml，水，水 450 ml 脱色液脱色液Gel Destaining Buffer 5L 甲醇甲醇 100 ml，乙酸，乙酸100 ml，加水至，加水至1000 ml 培养基培养基 LB培养基培养基 胰蛋白胨（胰蛋白胨（TRYPTONE）10g，酵母浸出物，酵母浸出物5g，氯化钠，氯化钠10g，调，调pH至至7.0，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1L。YPD培养基培养基 蛋白胨（蛋白胨（Peptone）20g，酵母浸出物，酵母浸出物10g，葡萄糖，葡萄糖20g，调节调节pH至至6.5，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1L。BMMY 蛋白胨（蛋白胨（Peptone）20g，酵母浸出物，酵母浸出物10g，酵母氮碱，酵母氮碱3.4g，硫酸铵，硫酸铵10g，用，用pH7.0的的0.1mol/L磷酸钾缓冲液定磷酸钾缓冲液定容至容至1L。选择选择=结果结果汇报结束汇报结束 谢谢观看谢谢观看！欢迎提出您的宝贵意见！欢迎提出您的宝贵意见！
