1、子情境：酶制剂发酵产品检验-糖化酶活力测定 糖化酶简介以及其活性的测定原理糖化酶简介以及其活性的测定原理v 糖化酶的应用及生产糖化酶的应用及生产v 糖化酶的催化原理糖化酶的催化原理v 酶活测定方法酶活测定方法v 糖化酶的应用与生产糖化酶的应用与生产糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3Glucoamylase EC.3.2.1.3），），又名淀粉葡萄糖苷（又名淀粉葡萄糖苷（AmyloglucosidaseAmyloglucosidase）或）或-淀粉酶（淀粉酶（-amylaseamylase），），是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖
2、醛酸是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在的糖蛋白，分子量在60601000kDa 1000kDa 之间。之间。因发酵工业中大量因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发酵。酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发酵。糖化酶不仅用于酒类、酒精
3、生产和葡萄糖浆的制取，糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一。糖化酶在工业生产中的应用糖化酶在工业生产中的应用v 目前，工业中广泛使用黑曲目前，工业中广泛使用黑曲霉霉(Aspergillus nigerAspergillus niger)、泡盛曲霉泡盛曲霉(Aspergillus Aspergillus awamoriawamori)、米根霉、米根霉(Rhizopus oryzaeRhizopus oryzae)和臭曲和
4、臭曲霉霉(Aspergillus foetidusAspergillus foetidus)为生产菌株来发酵生产糖化为生产菌株来发酵生产糖化酶。酶。v 今天的实验用酶就是利用黑今天的实验用酶就是利用黑曲霉变异菌株进行液体深层曲霉变异菌株进行液体深层通风发酵后提取获得。通风发酵后提取获得。v 糖化酶的作用机制糖化酶的作用机制v 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，
5、与之相对的都是非还原端）依次水解与之相对的都是非还原端）依次水解a-1,4 a-1,4 糖苷键糖苷键,切下一个个葡萄糖单元，并像切下一个个葡萄糖单元，并像-淀粉酶一样淀粉酶一样,使水使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成解下来的葡萄糖发生构型变化，形成-D-D-葡萄糖。葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a-a-1,6 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解化酶也能微弱水解a-1,3 a-1,3 连接的碳链，但水解连接的碳链，但水解a-1,4 a-1,4 糖苷键的速度最快
6、，它一般都能将淀粉百分之百地水糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。解生成葡萄糖。酶活测定方法酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰兰爱农法（法）爱农法（法）、SchoorlSchoorl法（法）和法（法）和对硝基苯酚葡萄糖法（法）对硝基苯酚葡萄糖法（法）、3,5-3,5-二硝基水二硝基水杨酸杨酸(DNS)(DNS)等方法。等方法。本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pHpH范围是范围是4 46,6,温度范围是温度范围是404
7、06060）进行反）进行反应应，生成的葡萄糖用，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解，糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。次碘酸钠法：碘与碘与NaOHNaOH作用能生作用能生成成NaIONaIO，而而葡萄糖葡萄糖能定量地能定量地(1:1)(1:1)被被NaIONaIO氧化在酸性条氧化在酸性条件下，未与件下，未与C C6 6H H1212O O6 6 作用的作用的NaIONaIO可转变可转变成成I I2 2 析出析出,因此只因此只要用要用NaNa2 2S S2 2O O3 3 标准标准溶液滴定析出的
8、溶液滴定析出的I I2 2 ，便可计算出便可计算出未参与未参与反应的反应的NaIONaIO ，由，由此推导出糖化酶催此推导出糖化酶催化所产生的化所产生的C C6 6H H1212O O6 6 的含量。的含量。1.I1.I2 2 与与 NaOHNaOH作用作用:I I2 2+2 NaOH=NaIO+NaI+H+2 NaOH=NaIO+NaI+H2 2O O2.C2.C6 6H H1212O O6 6 与与NaIONaIO定量作用定量作用:C C6 6H H1212O O6 6+NaIO=C+NaIO=C6 6H H1212O O7 7+NaI+NaI3.C3.C6 6H H1212O O6 6反
9、应反应完后完后,剩余剩余的的NaIONaIO在在碱性条件碱性条件下发生歧化反应下发生歧化反应:3 NaIO=NaIO 3 NaIO=NaIO3 3+2 NaI+2 NaI4.4.歧化产物在歧化产物在酸性条件酸性条件下进一步下进一步作用生成作用生成I I2 2:NaIO NaIO3 3+5NaI+6H+5NaI+6H2 2SOSO4 4=3I=3I2 2+6Na+6Na2 2SOSO4 4+3H+3H2 2O O5.5.析出的析出的I I2 2 可用标准可用标准NaNa2 2S S2 2O O3 3 溶溶液滴定之液滴定之:I I2 2+2Na+2Na2 2S S2 2O O3 3=Na=Na2
10、2S S4 4O O6 6+2NaI+2NaI注释注释 在这一系列的反应中，在这一系列的反应中，1mol1mol葡萄糖与葡萄糖与1mol 1mol NaIONaIO作用，而作用，而1molI1molI2 2产生产生1molNaIO1molNaIO，因此，因此，1mol1mol葡萄糖与葡萄糖与1molI1molI2 2 相当。只要得出对照相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出
11、酶活。的量，从而计算出酶活。四、操作步骤四、操作步骤1.1.取取7 7个带塞的试管（其中个带塞的试管（其中3 3个测今年批次的酶活、另个测今年批次的酶活、另外外3 3个测去年批次的酶活、个测去年批次的酶活、1 1个作空白对照），分别个作空白对照），分别吸取吸取2%2%可溶性淀粉液可溶性淀粉液5ml5ml，加入，加入pH4.6pH4.6醋酸缓冲液醋酸缓冲液2.5ml2.5ml，混匀后于，混匀后于40 40 水浴中预热水浴中预热10min10min。2.2.加入酶液加入酶液0.5ml0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于于40 40，反应，反应10min1
12、0min；反应结束时，立即于沸水浴；反应结束时，立即于沸水浴加热加热5min5min使酶失活使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。此时应将试管的塞子打开）。3.3.取上述反应液取上述反应液5ml5ml于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入0.1N0.1N碘液碘液5ml5ml，缓，缓慢加入慢加入0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH溶液溶液 5ml(5ml(注意注意:加碱速度不能加碱速度不能过快过快,否则过量否则过量NaIO NaIO 来不及氧化来不及氧化C C6 6H H1212O O6 6 而歧化为不与而歧化为不与C C6 6H H1212O O6 6反应的反应的NaIONaIO3 3
13、 和和NaI,NaI,使测定结果偏低使测定结果偏低)，摇匀摇匀后在暗处放置后在暗处放置15min15min后加入后加入2mol/L2mol/L硫酸硫酸2ml2ml；4.4.以以0.5%0.5%可溶性淀粉为指示剂（可溶性淀粉为指示剂（4-54-5滴即可），用滴即可），用0.1N0.1N硫硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N0.1N硫代硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A A）、空白对照）、空白对照（B B）；）；5.5.计算：计算：(1)(1)在上述条件下，在上述条件下，1ml1ml酶液每小时催化酶液每小时催化2%2
14、%淀粉溶液生成淀粉溶液生成1mg1mg葡萄糖的酶量定义为葡萄糖的酶量定义为1 1个酶活力单位：个酶活力单位：酶活力单位（酶活力单位（U/mlU/ml）=（B BA A）（N/2N/2）180.1 180.1（8/58/5）2 2（60/1060/10）式中式中:BB空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（mlml）数；）数；AA酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（mlml）数（取）数（取3 3次滴次滴定的平均值）；定的平均值）；NN硫代硫酸钠的当量浓度。硫代硫酸钠的当量浓度。180.1180.1葡萄糖的摩尔质量。葡萄糖的摩尔质量。8/58/5表示从表
15、示从8ml8ml酶反应体系取出酶反应体系取出5ml5ml反应液。反应液。22所加酶液为所加酶液为0.5ml0.5ml，按定义为，按定义为1ml1ml。60/1060/10表示酶反应时间为表示酶反应时间为10min10min，按定义为，按定义为1h1h。（2 2）在上述条件下，）在上述条件下，1ml1ml酶液每分钟催化酶液每分钟催化2%2%淀粉溶液水解生成淀粉溶液水解生成1mol1mol葡萄糖的酶量定义为葡萄糖的酶量定义为1 1个酶活力单位（个酶活力单位（U U）：）：酶活力单位（酶活力单位（U/mlU/ml）=（B BA A）1010-3 3（N/2N/2）（8/58/5）10106 62 2
16、 （1/101/10）式中符号与前式相同式中符号与前式相同，其中其中：10 10-3 ml3 ml换算成换算成L L。10106 6 molmol换算成换算成molmol。方法二：方法二：DNSDNS法测定糖化酶活力法测定糖化酶活力糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解末端开始，分解-1,4-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)氧化成葡萄糖酸，而氧化成葡萄糖酸，而3,5-3,5-二
17、硝基水杨酸被还原成红褐色的二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。操作步骤操作步骤1 1、葡萄糖标准曲线的绘制葡萄糖标准曲线的绘制 取取7 7支支25mL25mL具塞刻度具塞刻度比色比色管编号，按表管编号，按表1 1分别加
18、入浓分别加入浓度为度为1mg/mL1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-3,5-二硝基水二硝基水杨酸（杨酸（DNSDNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。将各管摇匀，在沸水浴中准确加热将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长调波长540nm540nm，用，用0 0号管调零点，测出号管调零点，测出1616号号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量
19、（管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（mgmg）为横坐标，做出标准曲线。为横坐标，做出标准曲线。2 2、糖化酶活、糖化酶活力力测定测定v 将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至20402040单位单位/毫升，制成酶制备；毫升，制成酶制备；v 取甲、乙两比色管（取甲、乙两比色管（5050毫升），分别加入毫升），分别加入2%2%可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液25ml25ml和和0.1M0.1M醋酸醋酸-醋酸钠缓冲溶液醋酸钠缓冲溶液5ml5ml，摇匀，放入，摇匀，放入4040士士0.20.2的恒温水浴锅中水浴的恒温水浴锅中水浴5-105-10分钟；在甲管中加酶制备液分钟；在甲管中加
20、酶制备液2ml,2ml,摇匀，并记录时间，反应摇匀，并记录时间，反应1010分钟后分钟后,立即加入立即加入20%NaOH20%NaOH溶溶液液0.20.2毫升毫升,摇匀；将两管取出冷却摇匀；将两管取出冷却,并于乙管中补加入酶制备并于乙管中补加入酶制备液液2 2毫升毫升(作为空白对照作为空白对照)；v 取上述反应液取上述反应液2 2毫升放于盛有毫升放于盛有2 2毫升毫升3,53,5一二硝基水杨酸的一二硝基水杨酸的2525毫毫升比色管升比色管 中中,按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。由吸光度值从工作曲线上查得葡萄糖的毫克数由吸光度值从工作曲线上查得葡萄
21、糖的毫克数,再按下面的公再按下面的公式计算酶活力单位。式计算酶活力单位。0-7沸水浴加热沸水浴加热5min5min，取出、冷却至室温，取出、冷却至室温，蒸馏水定容至蒸馏水定容至25ml25ml，颠倒混匀，测吸光度，颠倒混匀，测吸光度以以吸光度吸光度值为纵坐标，葡萄糖值为纵坐标，葡萄糖含量（含量（mgmg）为横坐标，做出标准曲线。）为横坐标，做出标准曲线。糖化酶活性测定过程甲甲乙乙加加25ml25ml可溶性淀粉（可溶性淀粉（2%2%）加加5ml5ml醋酸醋酸-醋酸钠缓冲溶液（醋酸钠缓冲溶液（0.1M0.1M）4040士士0.20.2水浴水浴 5-10min 5-10min加糖化酶液加糖化酶液2m
22、2ml l-4040士士0.20.2水浴水浴 10min 10min加加0.2mlNaOH（20%）、冷却）、冷却糖化酶活糖化酶活力力测定过程测定过程加糖化酶液2ml-甲乙取上述反应液2毫升放于盛有2毫升3,5一二硝基水杨酸的25毫升容量瓶中,按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。由吸光度值从工作曲线上查得葡萄糖的毫克数,再按公式计算酶活力单位。计算计算v 以以1 1克酶粉剂或克酶粉剂或1 1升发酵酶液在升发酵酶液在4040时时pHpH为为4.64.6条件下条件下,1,1小时分解可溶小时分解可溶性淀粉产生性淀粉产生1 1毫克葡萄的酶量定义为一个酶活性单位。毫克葡萄的酶量定义为一个酶活性单位。v 酶活力单位酶活力单位 =相当于吸光度的葡萄糖毫克数相当于吸光度的葡萄糖毫克数v 1/21/2一折算成一折算成1 1毫升酶液的量；毫升酶液的量；v 32.2 32.2 一反应液总体积的毫升数，一反应液总体积的毫升数，v(2)(2)一吸取反应液毫升数一吸取反应液毫升数;v 60/1060/10一转化成一转化成1 1小时的活性小时的活性v n n一稀释倍数一稀释倍数;v k k一常数一常数(包括时间包括时间,双糖影响等双糖影响等)kn1060)2(2.3221
