1、 1 新情境 激趣引航 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在 皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫 克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地 用于分子生物学的各个领域。例如梅毒。 2 新课堂 互动探究 学习目标 1.尝试PCR技术的基本操作。 2.使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法。 3.理解PCR的原理。 4.讨论PCR的应用。 新知预习 一、PCR原理 1概念：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量 的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 2DNA复制需要的条件： 解旋酶、DN
2、A母链、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。 激趣应用1 DNA复制为什么还需要引物？ 提示： DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3端延伸DNA链。因 此，DNA复制需要引物，DNA的合成方向总是从子链的5端向3 端延伸。 3DNA的热变性：在80100的温度范围内，DNA的双螺旋 结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两 条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 4PCR反应的条件 一定的缓冲溶液；DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种 引物；四种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合 酶；控制温度。 二、PCR反应过程 1变性：
3、当温度上升到90以上时，双链DNA解旋为单链，一 般实验温度为95。 2复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与 两条单链DNA结合，一般实验温度为55。 3延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 Taq_DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。 激趣应用2 细胞内的DNA是怎样复制的？ (1)回忆并简述DNA的复制过程。 (2)PCR的变性过程实质上也是解旋，PCR的解旋和细胞内的DNA 解旋有何不同？ 提示： (1)DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段 母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一 段子链，随着
4、模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同 时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。 (2)PCR在高温条件下(90100)解旋，而细胞内的DNA在解旋 酶的作用下解旋。 三、实验操作 1PCR仪：能够自动调控温度的仪器，实现DNA的扩增。如果 没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时在3个水浴锅中来回转 移PCR反应的微量离心管。 2微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5_mL。 3微量移液器：用于添加转移PCR配方中的液体。 四、操作提示 1为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使 用前必须进行高压灭菌。 2PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存
5、。 3微量移液器的枪头在吸取试剂后必须更换。 激趣应用3 DNA在吸附性方面有何特点？ DNA很容易吸附在玻璃的表面，而不容易吸附在塑料的表面， 由此推测PCR用到的微量离心管是用何种材质加工制作的？ 提示：是用塑料加工制作的。 3 新课堂 互动探究 知识点一 生物体内的DNA复制与PCR反应的比较 细解教材 体内DNA复制 PCR反应 时期 细胞有丝分裂间期和减数第一次 分裂前的间期 体外随时进行 场所 活细胞内 细胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合 酶(Taq DNA聚合酶) 特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增 是否需缓 冲液 不需缓冲液 严格配制10倍浓缩 扩增
6、缓冲液 不 同 点 设备 无 严格控制温度变化 的温控设备 原料 4种脱氧核苷酸(A、G、C、T) 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制 模板 以DNA母链为模板 相同点 引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 特 别 提 醒 (1)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与 DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上， 需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模 板。 典例精析 2015 华中师大附中期中 下列关于PCR与DNA分子在细胞 内复制的相关说法正确的是( ) A解旋的原理
7、一样 B引物的合成一样 CPH条件的要求一样 D酶的最适温度不一样 【解析】 PCR技术的概念是PCR全称为聚合酶链式反应，是一 项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前 提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条 件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合 酶(Taq酶)，具体过程有高温变性：DNA解旋过程；低温复性： 引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链 DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，C正确。 【答案】 C 跟踪练习 1如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反 应过程的
8、条件中相同的是( ) A模板 B原料 C酶 D能量供应 【解析】 本题主要考查细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的知 识，意在考查考生对细胞内外DNA复制条件的理解。选项A模板不 同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目 的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选 项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等； 胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的Taq 酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而 PCR扩增主要由外界供能。 【答案】 B 知识点二 PCR操作 细解教材 1PCR解旋与复旋的
9、原理：DNA热变性与复性： 2PCR的反应过程(如图)： 3PCR扩增的计算与DNA含量的测定： (1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模 板，则循环n次后有2n个DNA；若开始有N0个DNA提供模板，则循环 n次后获得的子代DNA数目为N0 2n个。 (2)DNA含量的测定： DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有 关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下： 特 别 提 醒 (1)PCR过程中无解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的 温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分 解成单体。 (2
10、)复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间 并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。 典例精析 2015 华中师大附中期中PCR技术扩增DNA片断，其原理 与细胞内DNA复制类似(如下图所示)图中引物为单链DNA片段，它是 子链合成延伸的基础。下列说法正确的是( ) A从理论上推测，第一轮循环产物中就能得到含引物对的DNA 片断 B至少完成两轮循环，才能获得两条脱氧核苷酸链等长的DNA 片段 C三个循环后可得到5种长度的DNA片断 D30次循环后，所有的DNA单链上都有引物 【解析】 由于引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一 轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核
11、苷酸链都不等长，A错 误；由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮 循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘 图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物 中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，B错误；三个循环后 可得到5种长度的DNA片断，C正确；30次循环后，不是所有的DNA 单链上都有引物，D错误。 【答案】 C 跟踪练习 2. 2015 吉林一中质检下列有关PCR技术的叙述，错误的是 ( ) APCR技术一定需要解旋酶和DNA聚合酶 BDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3端 延伸DNA链 CPCR的引物的基本单位
12、是脱氧核苷酸或核糖核苷酸 D扩增DNA时，需要加入两种引物 【解析】 PCR需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶 不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3端延伸DNA链，B正 确；PCR中需要两种不同的引物，引物一般为一段DNA或RNA，基 本单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸，CD正确。 【答案】 A 4 新思维 随堂自测 1.PCR技术扩增DNA，需要的条件是 ( ) 目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶等 mRNA 核糖体 A B C D 【解析】 PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶 催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱 氧核苷酸是该过
13、程的原料。综上所述，A正确。 【答案】 A 2. 2015 华中师大附中期中 下列关于PCR的描述中，正确的是 ( ) PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增 DNA利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A B C D 【解析】 PCR技术的概念是PCR全称为聚合酶链式反应，是一 项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前 提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条 件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合 酶(Taq酶)，具体过程有高温变性：DNA解旋过程；低温复性： 引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。
14、PCR扩增中双链 DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【答案】 D 3. 2015 扬州中学考试 在PCR扩增DNA的实验中，预计一分子 DNA经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210 个DNA分子，那么不是出现该现象的原因是( ) ATaq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制 B系统设计欠妥 C循环次数不够 D引物不能与亲链结合 【解析】 PCR扩增没有得到应有的DNA分子数，有可能是 TaqDNA聚合酶活性不够或活性受抑制，可能形成的DNA少，故A正 确。系统设计欠妥会导致达不到预期的结果，故B正确。循环次数不 够会出现子代DNA分子数少，故C
15、正确。引物与亲链不能结合的情况 下不会出现子代，而不是少，故D错误。 【答案】 D 4PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相 同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目 的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这 种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题： (1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是： _。 (2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片 段处，还需要_、和_、 _等条件。 (3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分 子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核
16、苷酸和鸟嘌呤脱氧核 苷酸的数目分别是_和_个。 DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对 四种脱氧核苷酸 能量 酶 245 315 5将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌 细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲 代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌 DNA的状况如图所示。 (1)第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮 存的遗传信息完全相同的原因是 _ _。 (2)如果将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带 有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的_%。 (3)如果将第二代大肠
17、杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标 记的第二代大肠杆菌的DNA脱氧核苷酸单链约占总量的 _%。 它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板，通过碱基互 补配对原则合成的 50 25 6 新视点 名师讲座 PCR的常见问题 PCR技术实验很容易出现假阴性或假阳性的结果。常见的原因及 预防措施是： (1)出现假阴性 主要原因有：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物 设计不合理导致不能复制；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系 统的建立欠妥当；循环次数不够等等。 补救措施：在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5 10次循环。 预防措施：选用活力高、质量好的TaqDNA聚合酶；在提取DNA 模板时，要特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、 氯仿等。不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的 高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其要保证引 物3端与靶基因互补。 (2)出现假阳性 PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA 片段的大量增加，因此，模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原 因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。 预防措施：PCR操作时要注意做到：隔离操作区、分装试剂、简 化操作程序、使用一次性吸液枪头等。
