1、 实训七、银耳多糖的制备及鉴定实训七、银耳多糖的制备及鉴定 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解银耳多糖制备的基本原理 掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术 原理原理 银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。不含核酸、蛋白质类物质。可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再
2、用再用CTAB(CTAB(溴化十六烷基三甲铵溴化十六烷基三甲铵)络合法络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。材料用具材料用具 银耳子实体干品银耳子实体干品（50g50g左右）左右）烧杯烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。试剂试剂（1 1）1 1复合酶制剂复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)；（2 2）2 2溴化十六烷基三甲铵（溴化十六烷基
3、三甲铵（CTABCTAB）配制：）配制：取取2 g CTAB2 g CTAB溶于溶于100 mL100 mL蒸馏水中，摇匀备用；蒸馏水中，摇匀备用；（3 3）-萘酚配制：萘酚配制：-萘酚萘酚5g5g溶于溶于9595乙乙（4 4）5%5%三氯乙酸三氯乙酸-正丁醇溶液；正丁醇溶液；（5 5）2mol2molL L的氢氧化钠溶液；的氢氧化钠溶液；（6 6）甲苯胺乙醇溶液；）甲苯胺乙醇溶液；（7 7）2mol2molL L氯化钠溶液；氯化钠溶液；（8 8）2mol2molL L盐酸溶液；盐酸溶液；（9 9）活性炭；硅藻土。）活性炭；硅藻土。（1010）1 1融菌酶制剂；融菌酶制剂；（1111）无水乙醇
4、；）无水乙醇；（1212）浓硫酸；）浓硫酸；（1313）乙醚。）乙醚。操作方法操作方法 20 g锈钢锅中锈钢锅中 加水加水1600 mL 2025浸泡浸泡30min 捣碎机捣碎机中捣碎中捣碎 银耳银耳浆液浆液 操作方法操作方法2molL盐酸溶液调盐酸溶液调pH至至 加加入入1复复合合酶酶制制剂剂 50下下酶促反应酶促反应40min 银耳银耳浆液浆液 80灭酶，灭酶，保温浸提保温浸提约约 80水浴水浴浓缩浓缩 操作方法操作方法等体积等体积5三氯乙酸三氯乙酸-正丁醇溶液正丁醇溶液 摇匀摇匀 离心离心（3000r/min）15 min 浓缩液浓缩液 3.多糖的沉淀（有机酸除杂）多糖的沉淀（有机酸除杂
5、）下层下层清液清液备用备用 吸去上层吸去上层正丁醇正丁醇中层中层变性变性蛋白蛋白 操作方法操作方法2molL的氢氧化钠溶液调的氢氧化钠溶液调pH至至7 摇匀摇匀 抽滤抽滤 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（脱色、透析脱色、透析）下层下层清液清液备用备用 加加1活活性炭性炭80加热加热15 min脱色脱色 滤液扎袋滤液扎袋流水流水透析透析12h 80水水浴浓缩浴浓缩抽滤抽滤 操作方法操作方法加加3倍量倍量95乙醇乙醇 摇匀摇匀 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（乙醇沉析乙醇沉析）抽滤液抽滤液离心离心（3000r/min）15min 沉淀沉淀用无水用无水乙醇洗乙醇洗2次次 乙醚乙醚洗涤洗涤1次次 50以下以下
6、真空真空干燥干燥 操作方法操作方法4.精制（一）精制（一）取粗取粗品品1 g 溶于溶于100 mL水中水中 搅拌搅拌静置静置2h2 CTAB 滤液滤液 离心离心除不溶物除不溶物60解离解离4 h 离心离心3000r/min15 min80热水热水洗洗 氯氯化化钠钠 2molL溶溶液液100 mL 操作方法操作方法4.精制（二）精制（二）解离液解离液加加三三倍倍量量95乙乙醇醇 透析液透析液8080浓缩浓缩 离心离心3000r/min15 min精品精品银耳银耳多糖多糖 离心离心3000r/min15 min沉淀沉淀用无水用无水乙醇、乙醇、乙醚乙醚洗涤洗涤 上清液上清液流水流水透析透析10h 5
7、0真空真空干燥干燥 操作方法操作方法5.多糖的鉴定（一）多糖的鉴定（一）观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化 透析液透析液1 mL-萘酚溶液萘酚溶液2滴滴 颜色变化颜色变化摇匀摇匀 沿管壁沿管壁缓加缓加入浓硫入浓硫酸酸1.5 mL(勿振动勿振动)操作方法操作方法5.多糖的鉴定（二）多糖的鉴定（二）透析透析浓缩浓缩透析透析浓缩浓缩2 mL 点于滤纸点于滤纸 甲苯胺乙醇溶液染色甲苯胺乙醇溶液染色 加入加入2CTAB溶液溶液24滴滴 观察现象观察现象 注意事项注意事项1.1.酶促反应的时间、温度应控制好。酶促反应的时间、温度应控制好。2.2.在制备全流程中应时刻注意温度，在制备全流程中应时刻注意温度，不能超过不能超过8080 思考思考 题题1加入复合酶制剂有何作用？加入复合酶制剂有何作用？2CTABCTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？3为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过8080？结结 语语
