1、转基因水稻外源基因拷贝数检测转基因水稻外源基因拷贝数检测第二部分：分子杂交第二部分：分子杂交Southern BlottingDNA抽提抽提DNA酶切酶切酶切产物电泳酶切产物电泳转膜转膜烘膜烘膜预杂交预杂交探针准备及标记探针准备及标记杂交杂交洗膜洗膜/显影显影1212345679(kb)12335转基因植物拷贝数检测转基因植物拷贝数检测实验原理实验原理Hind IIIprobe酶切、转膜酶切、转膜杂交、显影杂交、显影不同的插入拷不同的插入拷贝产生不同大贝产生不同大小的杂交带小的杂交带HHHH1212345679(kb)12335植物总植物总DNADNA的快速少量抽提（的快速少量抽提（CTABC
2、TAB法）法）1.1.保证核酸一级结构的完整性。（保证核酸一级结构的完整性。（303050KB50KB）2.2.排除其它分子的污染排除其它分子的污染1.不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。过高浓度的金属离子。2.其它生物大分子的污染应降到最低程度。其它生物大分子的污染应降到最低程度。DNA纯化的要求纯化的要求分离纯化核酸总的原则分离纯化核酸总的原则CTABCTAB是一种非离子去污剂，是一种非离子去污剂，CTABCTAB与核酸形成与核酸形成复合物，此复合物在高盐（复合物，此复合物在高盐（0.7mM0.7mM）浓度下可溶，）浓度下可溶，并稳定
3、存在，但在低盐浓度（并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl0.1-0.5mM NaCl）下下CTAB-CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，弃上清后，CTAB-CTAB-核酸复合物再用核酸复合物再用707075%75%酒精浸酒精浸泡可洗脱掉泡可洗脱掉CTABCTAB。CTAB法原理：法原理：操作步骤：操作步骤：1.采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；研磨成细粉；2.取约取约0.4g左右细粉于
4、左右细粉于1.5ml离心管，加入离心管，加入1ml预热至预热至95C以上的以上的1.5 CTAB，混匀；，混匀；3.65C水浴中放置水浴中放置30分钟，每隔分钟，每隔5分钟上下颠分钟上下颠倒混合数次倒混合数次 (DNase变性，促进内溶物释放变性，促进内溶物释放)；4.12000g离心离心2分钟；分钟；5.吸取吸取600 l上清于新的上清于新的1.5ml离心管，加入等离心管，加入等体积氯仿体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1），上下颠倒混合至），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色；下层有机相呈深绿色；6.12000g12000g离心离心5-105-10分钟；分钟；7.7.吸取吸取450450 l
5、l上清于新的上清于新的1.5ml1.5ml离心管，加入两倍离心管，加入两倍体积体积9595乙醇和乙醇和1/101/10体积体积3M NaAc3M NaAc，轻轻的上，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现8.8.12000g12000g离心离心1010分钟；分钟；9.9.弃去上清。用弃去上清。用500500 l 7575乙醇浸洗沉淀乙醇浸洗沉淀5 5分钟，分钟，除去离子及除去离子及CTABCTAB残余，残余，12000g12000g离心离心5 5分钟，弃分钟，弃上清上清,自然干燥；自然干燥；10.10.加入加入5050 lTElTE（含（含2020 g/ml RNas
6、eAg/ml RNaseA），放于），放于4 4C C溶解；溶解；11.11.充分溶解后，测定并调整浓度充分溶解后，测定并调整浓度1尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用须用10mM10mM的的-ME-ME处理处理2 2研钵预冻，粉末转管前至加研钵预冻，粉末转管前至加CTABCTAB前不要融化前不要融化3 324:124:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行作要在通风柜中进行4 4实验操作戴手套实验操作戴手套 思考：思考：（1）试分析）试分析DNA降解的可能原因降解的可能原因 （2）提高）提高
7、DNA产量的措施产量的措施本实验注意事项：本实验注意事项：氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（24:124:1）：氯仿是有机溶剂，）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素，蛋白质和多糖等，异戊醇可去除植物色素，蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。质更有效。DNADNA沉淀：无水或沉淀：无水或9595的乙醇，异丙醇的乙醇，异丙醇 3M NaAC(3M NaAC(或或10M NH10M NH4 4ACAC）协助乙醇沉淀协助乙醇沉淀DNADNA。75%75%乙醇去除微量
8、乙醇去除微量NaNa+、K K+、MgMg2+2+等阳离子及等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱小分子量的有机分子，洗脱CTABCTAB所用到的试剂及作用所用到的试剂及作用 TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并）溶解并长期保存长期保存DNA。EDTA螯合螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离等二价阳离子，从而抑制子，从而抑制DNase等的活性。等的活性。1.5 CTAB CTAB 15 g 1 M TrisCl(pH 8.0)75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml 外环境条件：外环境条件：pH8.
9、0防止脱氨作用；防止脱氨作用；65 CTAB中中DNase变性，促进内溶物释放；变性，促进内溶物释放；离心时离心时15以防以防CTAB沉淀而降低沉淀而降低DNA量。量。1.1.DNADNA纯度纯度：吸光值检测：检测吸光值检测：检测260nm260nm、280nm280nm吸吸光值，紫外分光光度计光值，紫外分光光度计A A260260/A/A280280=1.8=1.81.91.9；1.81.8最佳，低于最佳，低于1.81.8说明有蛋白质，大于说明有蛋白质，大于1.81.8说说明有明有RNARNA。2.2.电泳检测电泳检测DNADNA大小：大小：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNA质量检测质量检测
10、Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1g/ml，分析范围可延至15g/ml，但会降低一定的灵敏度。缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。DNADNA的定量的定量（1）荧光检测仪）荧光检测仪1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA（2.）分光光度计分光光度计
11、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在在pHpH值为值为8.08.08.38.3时，核酸分子带负电，时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为
12、电泳支持物，在分子筛的作的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如染料（如EBEB）后，在紫外灯下可观察到核酸）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。片段所在的位置。实验原理：实验原理：影响影响DNA迁移速率的因素迁移速率的因素 DNADNA分子大小分子大小：迁移速率迁移速率U U与与logNlogN成反比（成反比（N N为碱基对为碱基对数目）。分子越大，迁移越
13、慢。等量的空间结构紧密的数目）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋电泳快（超螺旋 线性线性DNADNA）琼脂糖浓度琼脂糖浓度：logU=logUlogU=logU0 0 Kr Kr 胶浓度，胶浓度，U U为迁移率，为迁移率，U U0 0 为为DNADNA的自由电泳迁移率，的自由电泳迁移率，为胶浓度，为胶浓度，KrKr为介质阻为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA DNA AgaroseAgarose：0.5%0.5%：1-30 kb1-30 kb；0.7%0.7%：0.8-12 kb0.8-12 kb 1.2%1.2%：0
14、.4-7 kb0.4-7 kb；1.5%1.5%：0.2-3 kb.0.2-3 kb.DNADNA构象构象：一般迁移速率超螺旋环状一般迁移速率超螺旋环状 线状线状DNADNA单链开环。单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及度、离子强度及EBEB含量有关。含量有关。所加电压所加电压：低电压时，线状低电压时，线状DNADNA片段的迁移速率与所加电片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5V/cm碱基组成与温度碱基组成与温度：一般影
15、响不大：一般影响不大4-30 4-30 嵌入染料的存在嵌入染料的存在：降低线性降低线性DNADNA迁移率，迁移率，(不提不提倡加在电泳液中倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响影响DNADNA的的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNADNA变变性，一般采用性，一般采用1 1TAETAE，0.5TBETBE，1 1TPETPE（均（均含含EDTA pH8.0EDTA pH8.0）实验步骤：实验步骤：1.1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好
16、，用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；水平放置在工作台上；2.2.调整好梳子的高度；调整好梳子的高度；3.3.称取称取0.24 g0.24 g琼脂糖于琼脂糖于30 ml 0.530 ml 0.5TBETBE中，中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；至温热时倒胶；4.4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5.5.将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中；次点入加样孔中；6.6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打将制胶板放入电泳槽中，加入电
17、泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点（注意点样孔在电泳槽的负极一端）样孔在电泳槽的负极一端）；7.7.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 0.5 g/mlg/ml的溴化乙锭（的溴化乙锭（EBEB）中浸泡）中浸泡101015 min15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。照相记录。电泳指示剂：电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的
18、的迁移率比溴酚蓝慢。1.含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2.含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液：上样缓冲液：实验室常用核酸染料 EB Gel red（UniRed）/Gel green Sybr green I Sybr Green II（RNA）Gold ViewEB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000贮存液(0.5mg/mL)，使用时按1：1000稀释配制染色液。EB的去除有特定的识别序列有特定的识别序列 ，通常为，通常为4 46 6碱
19、基的回文碱基的回文对称序列。对称序列。切割位点位于识别序列内的固定位置上，切切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在割后在5 5末端有磷酸基团，末端有磷酸基团，3 3末端有羟基。末端有羟基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3 3突出端（如突出端（如PstPstI I）和）和5 5突出端突出端(如如EcoEcoRI)RI)两种两种其活性发挥只需其活性发挥只需MgMg2 2作辅酶。作辅酶。II类限制性内切酶的特点类限制性内切酶的特点限制酶的一个活性单位（限制酶的一个活性单位（1U1U）：）：原则上指在50l 反应体系中，37下，经过1小时的反应将1
20、g的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的限制酶的star活性：活性：限制酶在某些极端非标准条件下对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。引起星星活性的主要因素：引起星星活性的主要因素：高浓度的甘油（高浓度的甘油（5）；）；酶过量（酶过量（100U/g）；）；低离子强度（低离子强度（pH8.0)；有机溶剂（有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶对上
21、述因素的敏感程度不同不同的酶对上述因素的敏感程度不同氯化镁、氯化钠氯化镁、氯化钠/钾、钾、Tris盐酸盐、盐酸盐、巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：注意注意1.1.注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了酶的浓度和最适作用条件，不要用错了bufferbuffer和作和作用的温度等用的温度等2.2.涉及到酶的操作时涉及到酶的操作时,一律在冰上操作一律在冰上操作3.3.使用移液器吸取酶时，使用移液器吸取酶时，tiptip头
22、只能刚刚插入液面吸取头只能刚刚插入液面吸取4.4.如果有多个反应，酶、如果有多个反应，酶、bufferbuffer、水等应配制成、水等应配制成mixturemixture再分装再分装5.5.各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心检测检测DNADNA质量质量测量测量DNADNA浓度浓度所有所有DNADNA样品的浓度调整到大致相同样品的浓度调整到大致相同限制性内切酶操作限制性内切酶操作准备：准备：DNA(DNA(g)g)10 10 l l1010*buffer reaction buffer reaction 2 2 l lEnzyme(10U)E
23、nzyme(10U)1 1 l(10l(10U/U/l)l)H H2 2O 7 O 7 l l 20 20 l l酶切体系：酶切体系：注意：冰上操作 1 5 DNA10 l (ddH2O)Hind(10U/l)1 l 5 l 10buffer2 l 10 l ddH2O 7 l 35 l Total 20 l 37C 酶切过夜酶切体系酶切体系混匀分装电泳检测酶切效率：每样品电泳检测酶切效率：每样品1/101/10量上样，电泳检量上样，电泳检测。测。若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做否则重做 。出现切烂：出现切烂：DNADNA降解，重新提降解
24、，重新提DNADNA；切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。溶剂等），重新纯化。酶切效果检测：酶切效果检测：A1优总优总DNA A2劣总劣总DNA B1 酶切烂酶切烂 B2酶切优酶切优 B3切不动切不动总总DNA酶切电泳检测酶切电泳检测1212345679(kb)12335酶切反应的终止酶切反应的终止1.加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应2.多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活，少数65C不失活的酶在75 C 15分钟也能失活3.若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化造成造成DNA酶切不
25、完全的主要原因有：酶切不完全的主要原因有：操作不当，酶或操作不当，酶或DNADNA加至管壁上，反应体系加至管壁上，反应体系没完全混合；混和后应短暂离心；没完全混合；混和后应短暂离心；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；适；酶的活力不够酶的活力不够 DNADNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 样品中的蛋白质、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性解决办法：1.增加酶作用的单位数（10-20U/g DNA)2.增大反应体积以稀释可能的抑制剂3.延
26、长反应时间4.消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。5.纯化DNA1.胶浓度胶浓度0.7-0.8%。2.胶厚度胶厚度 5mm(250ml胶胶)。3.胶的均一性胶的均一性(不同样品的迁移率一致不同样品的迁移率一致)。4.样品样品DNA量量5.指示剂量稍大，长时间指示。指示剂量稍大，长时间指示。6.点样顺序：点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组，阳性对照，阴性对照，本组样品样品7.电泳电压：大电泳槽电泳电压：大电泳槽40V，12小时，小时，1-1.5V/cm。8.电泳结束，指示剂约移动电泳结束，指示剂约移动1
27、0-11cm。电泳电泳转膜的方式：转膜的方式：1.Upward Capillary Transfer(Figure 1)2.Downward Capillary Transfer(Figure 2)3.Simultaneous Transfer to Two Membranes4.Electrophoretic Transfer5.Vacuum Transfer转膜转膜Upward Capillary TransferUpward Capillary TransferDownward Capillary Transfer 尼龙膜：高强度，不易破损，与尼龙膜：高强度，不易破损，与DNA共价共价结
28、合，反复使用结合，反复使用10次以上不破损，不丢失次以上不破损，不丢失DNA，吸附，吸附DNA每每cm2比硝酸膜多比硝酸膜多5倍，倍，50bp有效杂交。有效杂交。硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失失DNA，不能与膜结合。转移缓冲液（转移缓冲液（transfer buffertransfer buffer）DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作 转膜时间转膜时间（duration of transferduration of transfer，12hrs12hrs）取决
29、于毛细吸附系统取决于毛细吸附系统胶厚度胶厚度(5mm)及浓度及浓度(1%)大小：分子量大小决定时间大小：分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小，碱转长短，部分去嘌呤减小，碱转hrs大部分结合到膜。大部分结合到膜。尼龙膜（带正电荷的）具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸能够不可逆结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能(无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以上次），经毛细吸附作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，再在80-100真空干燥2 hrs，即可固定DNA。操作步骤操作步骤制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（3000Ci/mmol)3000Ci/mmol),半衰期半衰期14.314.3天，最大能量天，最大能量1.71 Mev1.71 Mev，最大辐射范，最大辐射范围：空气中围：空气中610cm610cm，水中，水中0.8cm0.8cm，有机玻璃中，有机玻璃中0.76cm.0.76cm.或或 DIG-11-dUTP
