1、n分为两个阶段分为两个阶段第一阶段：特异性结合第一阶段：特异性结合不可见不可见 第二阶段：免疫复合物沉积第二阶段：免疫复合物沉积可见可见物质基础物质基础:抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合结合 抗原抗体之间的结合力抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体静电引力静电引力（electrostatic forces）范德华引力范德华引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键氢键:最具特异性最具特异性（hydrogen bond
2、）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大（hydrophobic interactions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力抗原抗体结合力n亲和性亲和性是抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗是抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间的相适应性而存在着的引力，这是原决定簇之间的相适应性而存在着的引力，这是抗原与抗体之间固有的结合力。抗原与抗体之间固有的结合力。n抗体抗体亲合力亲合力是指反应系统中复杂抗原与相应抗体是指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力。多价优势。之间的结合能力。多价优势。返回返回 亲水胶体亲水胶体疏水胶体疏水胶体转化转化NaCl可见反应可见反应
3、可见反应可见反应(沉淀沉淀)抗原抗体复合物抗原抗体复合物 (疏水胶体疏水胶体)电解质电解质 抗原抗原(亲水胶体亲水胶体)抗体抗体(亲水胶体亲水胶体)+特异性：特异性：抗原与抗原与抗体结合反应的抗体结合反应的专一性专一性抗原抗体反应特异性示意图抗原抗体反应特异性示意图分子基础：分子基础：抗原表位与抗体抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的分子高变区之间空间构型的互补性互补性 交叉反应交叉反应前带：抗体过量前带：抗体过量后带：抗原过量后带：抗原过量等价带：抗原抗体比例合适等价带：抗原抗体比例合适 抗原抗体反应比例性示意图抗原抗体反应比例性示意图比例性：比例性：抗原与抗体抗原与抗体发生可见反应需遵循
4、发生可见反应需遵循一定的量比关系一定的量比关系网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗体过量抗体过量比例合适比例合适抗原的量抗原的量抗原过量抗原过量抗体沉淀的量抗体沉淀的量前带前带等价带等价带后带后带抗体抗体混有混有AgAg抗体抗体-Ag-Ag抗体抗体-Ag-Ag分离剂分离剂一、抗原抗体结合一、抗原抗体结合二、分离抗体二、分离抗体抗体抗体111可逆性可逆性K（亲和常数）=Ag+AbAg Ab*抗体：抗体：1.来源来源 2.特异性与亲合力特异性与亲合力 3.浓度浓度 来源：来自不同动物的免疫血清，其反应性有来源：来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家
5、兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（并且在高盐浓度（80g/L）NaCl溶液中沉淀现象溶液中沉淀现象明显。明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。酸碱度酸
6、碱度温度温度作用时间作用时间抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。性抗体的血清。多克隆抗体多克隆抗体（PAb）：）：多个抗原决定簇免疫机多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。体所产生的多种抗体的混合物。多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体第三节第三节 抗血
7、清的制备和抗体的纯化抗血清的制备和抗体的纯化Ag1234AgB1B2B3B4B3B3B3B32 多克隆抗体341 抗体的性质相同，容易纯化、标记。n 抗体的纯化、标记比单抗难，因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时，血清中含有的杂蛋白比较多。制备单克隆抗体的基本原理：致敏的致敏的B淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞（myeloma）（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存 ）但能在体外长期生存）阳性杂交瘤细胞阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养克隆化培养 （产生单克隆的阳性杂交瘤细胞
8、）生产单克隆抗体生产单克隆抗体 1222212脾脏细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞融合基础免疫：首次，抗原用量大，用弗式完全佐剂（Complate Freund adjuvand，含矿物油，卡介苗等）。加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用弗式不完全佐剂（Incomplate Freund adjuvand，不含卡介苗）。+带负电荷 的被吸附上带负电荷少的先被置换带负电荷多的后被置换使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)抗原与抗体结合后，只有出现可见抗原与抗体结合后，只有出现可见的反应，如凝集、溶血、沉淀试验等，的反应，如凝集、溶血、沉淀试验等，或用荧光素、酶、放射性
9、同位素等标记或用荧光素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测性，才便于在免疫检测中方法提高可测性，才便于在免疫检测中运用。运用。可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说，一方面在进行免疫检测时多。这就是说，一方面在进行免疫检测时要注意抗原、抗体的用量；另一方面只要要注意抗原、抗体的用量；另一方面只要提高可见度或可测性，便可大大提高免疫提高可见度或可测性，便可大大提高免疫检测方法的灵敏度。检测方法的灵敏度。反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断凝集反应凝集反应 直接凝集试验
10、直接凝集试验观察凝集现象观察凝集现象间接凝集试验间接凝集试验同上同上抗球蛋白试验抗球蛋白试验同上同上沉淀反应沉淀反应 液相沉淀试验液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉淀弧观察扫描沉淀峰、沉淀弧补体参与补体参与的反应的反应补体溶血试验补体溶血试验观察测定溶血现象观察测定溶血现象补体结合试验补体结合试验同上同上+（2）试管法）试管法半定量试验：半定量试验：诊断伤寒副伤寒的诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应肥达氏反应”病人血清病人血清倍比稀释倍比稀释伤寒细菌悬液1:21:41:81:161:321:64对照对照凝集程度凝集程度沉淀沉淀上清上清管底沉淀管
11、底沉淀凝集程度凝集程度最高稀释比例最高稀释比例待测血清的滴度待测血清的滴度一般当H1：160，O1：80，副伤寒凝集价1：80时，才有诊断意义。2、间接凝集反应、间接凝集反应+载体：红载体：红 血血 球：球：间接血凝试验间接血凝试验 乳胶颗粒：乳胶颗粒：间接乳胶凝集试验间接乳胶凝集试验 载体载体可溶性抗原可溶性抗原致敏致敏致敏颗粒致敏颗粒NSNS凝集颗粒凝集颗粒常用的载体颗粒有人 O 型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒是红细胞，称间接血凝试验；若为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。如用乳胶凝集试验测定相关抗体，可用于辅助诊断钩体病、血吸虫病、类风湿性关节炎等。3、间接凝集抑制试验+尿液标
12、本尿液标本（HCG？）？）抗抗HCG抗体抗体HCG致敏乳胶致敏乳胶不凝集不凝集结果判定结果判定凝集凝集阳性阳性阴性阴性（适当条件）（适当条件）可溶性可溶性Ag相应相应Ab 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验n单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验n双向扩散试验双向扩散试验 凝胶免疫电泳技术凝胶免疫电泳技术u对流免疫电泳对流免疫电泳u免疫电泳免疫电泳u火箭免疫电泳火箭免疫电泳u免疫固定电泳免疫固定电泳在在Ab浓度不变的情况下随着浓度不变的情况下随着Ag浓度不断上升免疫沉淀反应浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图所示变化如图所示AbAgAg各管各管Ag倍比稀释倍比稀释加入抗血清各管各管Ab量不变量不变振摇 混匀、
13、37孵育沉淀量不同沉淀量不同轻摇染色标本图染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散抗原抗体双向自由扩散2.24 h 出结果出结果3.呈现沉淀线或弧呈现沉淀线或弧3.Precipitation Reactions3.Precipitation ReactionsFIGURE 6-5Diagrammatic representation of radial&double immunodiffusion.:precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines;no visible precipitate forms in region
14、s of Ab or Ag excess.in the Ab-containing semisolid mediumThe region of equivalence-The area is proportional to the conc.of Ag.AgAb扩散扩散AgAb扩散扩散1:21:41:81:161:321:64A:浓度浓度Ag、Ab及扩散率近似及扩散率近似B：浓度：浓度Ag、Ab近似，扩散率近似，扩散率AgAb C：浓度：浓度Ag、Ab近似，扩散率近似，扩散率AgAb D：浓度：浓度AgAb，扩散率近似，扩散率近似E：浓度：浓度AgAb，扩散率，扩散率AgAb F：浓度：浓度A
15、gAb，扩散率，扩散率AgAb 沉沉淀环大小与淀环大小与Ag浓度呈正相关。浓度呈正相关。倾注平板打孔加样倾注平板打孔加样 放置放置372448h观察沉淀环观察沉淀环 单向扩散试验（平板法）单向扩散试验（平板法）含抗人含抗人IgG琼脂琼脂制成平板制成平板待测血样待测血样(IgG浓度浓度?)标准人标准人IgG不同浓度不同浓度制作标准曲线制作标准曲线待测样品结果待测样品结果1.1.测定沉淀环直径测定沉淀环直径2.2.在标准曲线上查找在标准曲线上查找 相应抗原浓度相应抗原浓度5.免疫电泳试验免疫电泳试验 当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结合并形成抗原抗体复合物后，可结合补
16、体合并形成抗原抗体复合物后，可结合补体引起溶菌、溶血效应。引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既可以测知患者血清用补体结合试验既可以测知患者血清中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗体的量。体的量。反应的过程是首先加待测抗原反应的过程是首先加待测抗原/抗体，反应一抗体，反应一段时间后加入补体，在反应一段时间后加指段时间后加入补体，在反应一段时间后加指示系统。示系统。有待测抗原抗体结合时，必然结合补体，不有待测抗原抗体结合时，必然结合补体，不会出现溶血，没有待测物质时出现溶血。会出现溶血，没有待测物质时出现溶血。指示系统指示系统:绵羊红细胞绵羊红细胞+溶血素溶血素+补体补体待检系统待检系统:已知已知Ag+未知未知Ab 或已知或已知Ab+未知未知Ag。AgAbCAgCRBC溶血素溶血素RBC溶血素溶血素C不溶血不溶血溶血溶血已知效价的抗血清（通常为阴性对照）测定未知效价的抗血清结果以中和指数表示 试验组LD50(EID50、TCID50)中和指数=对照组LD50(EID50、TCID50)已知效价（滴度）的病毒测定抗血清的效价结果以血清中中和抗体滴度表示
