1、Chapter 4 Animal Cell Culture Biology of cells in culture Fluid for cell culture Standard cell culture techniques Establishing a cell line or cell strain Cell freezing and recoveryAnimal Cell EngineeringSection 5：细胞系和细胞株的建立细胞系和细胞株的建立一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程以人上皮型鼻咽癌以人上皮型鼻咽癌CNE-2CNE-2细胞系的建立为例细
2、胞系的建立为例问题：问题：具体的建系过程应该包括？具体的建系过程应该包括？1.1.取材取材用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者的鼻咽部肿物获得组织块。2.2.原代培养原代培养1）鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液内，于4下静置2小时。2）然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。3）37、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养。3.3.建系过程建系过程组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维
3、细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功克隆细胞株克隆细胞株 v通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的获得的稳定的稳定的、具有特殊性质或标志具有特殊性质或标志的培养物。的培养物。v稳定的特殊标记稳定的特殊标记，如：染色体组型，特殊的染色体，如：染色体组型，特殊的染色体标志或特定的同功酶谱。标志或
4、特定的同功酶谱。v特殊性质特殊性质，如：一定的生化特性，温度敏感突变株，如：一定的生化特性，温度敏感突变株二、二、细胞株细胞株的建立过程的建立过程1.1.细胞克隆技术细胞克隆技术(p59)(p59)v培育细胞株可采用细胞克隆技术。培育细胞株可采用细胞克隆技术。v一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化胞群体的方法称为克隆化(cloning)。2.2.细胞克隆培养的技术方法细胞克隆培养的技术方法 稀释铺板法稀释铺板法 饲养层克隆法饲养层克隆法 胶原膜板或血纤维蛋白膜板克
5、隆法胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法 琼脂克隆法琼脂克隆法 毛细管单细胞克隆法毛细管单细胞克隆法饲养层克隆法饲养层克隆法饲养细胞：一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。制备过程过程如下：饲细胞层克隆法琼脂克隆培养3.3.影响影响克隆形成率克隆形成率的因素的因素 接种细胞的密度接种细胞的密度 培养基、血清培养基、血清 饲养细胞饲养细胞 激素和生长因子激素和生长因子 CO2CO2、适应性生长基质、适应性生长基质 原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具
6、有增胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系胞系(或株或株)。三、细胞系（或株）的鉴定三、细胞系（或株）的鉴定1.1.细胞系鉴定指标细胞系鉴定指标当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)1)细胞系的细胞来源细胞系的细胞来源；2)2)细胞系的纯度细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞；，即除了主类细胞外，还杂有哪
7、类细胞；3)3)细胞系的稳定性细胞系的稳定性，即细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化；，即细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化；4)4)累积累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源，以及其与来源细胞的差异等细胞的差异等2.2.细胞系的鉴定方法细胞系的鉴定方法1）形态学形态学：活细胞观察；固定染色观察培养细胞。活细胞观察；固定染色观察培养细胞。2）染色体染色体：染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。采用染色体数目染色体数目、核型
8、分析核型分析以及染色体分带技术染色体分带技术检测。3）同工酶谱同工酶谱：通常采用通常采用G6PD(葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。据条件选择。4）细胞细胞DNA遗传特征遗传特征:限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP)是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能
9、在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。一般采用Southern印迹杂交法检测。细胞转化及恶性程度检查 一般利用软琼脂培养法检测四、档案资料的建立及其管理四、档案资料的建立及其管理 细胞系（或株）的建立者细胞系（或株）的建立者 组织来源组织来源 细胞学性状细胞学性状 培养条件和方法培养条件和方法 冻存液等冻存液等建立细胞株（系）的要求 组织起源和已经传代的代数 冻存液 细胞活力 培养液：培养基、血清和抗生素 融解后细胞生长特性 接种存活率 细胞形态 核型 无菌检测：细菌、真菌等 物种检测：检测同工酶谱 反转录酶检测 细胞建立者 检测者以美国ATCC细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库。细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天传代，每次接种天传代，每次接种3105细胞毫升。细胞毫升。
