1、第六章第六章 沉淀反应沉淀反应第一节第一节 沉淀反应原理及特点沉淀反应原理及特点沉淀反应（沉淀反应（precipitationprecipitation）是指可溶性抗原与相应抗是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象性结合而出现的沉淀现象。与经典的抗原抗体与经典的抗原抗体反应相同反应相同原理原理特点特点 抗原抗体特异性结合，抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合用此阶段测定免疫复合物形成的速率物形成的速率形成肉眼可见的大的免形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉疫
2、复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物定此阶段形成的复合物第一阶段第一阶段第二阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段沉淀反应分两个阶段免疫免疫浊度浊度测定测定絮状絮状沉淀沉淀试验试验单向单向扩散扩散试验试验双向双向扩散扩散试验试验对流免疫对流免疫电泳电泳火箭免疫火箭免疫电泳电泳免疫电泳免疫电泳免疫固定免疫固定电泳电泳沉淀反应可分为三大类型沉淀反应可分为三大类型液体内沉液体内沉淀试验淀试验凝胶内沉凝胶内沉淀试验淀试验凝胶免疫凝胶免疫电泳技术电泳技术第二节液体内沉淀试验第二节液体内沉淀试验 絮状沉淀试验絮状沉淀试验 （floc
3、culationflocculation）絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法受抗原抗体比例的影响非常明显方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型三种类型)絮状沉淀试验絮状沉淀试验 抗原稀释法：抗原最适比例抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例表表 最适比方阵测定法最适比方阵测定法抗
4、体抗体稀释度稀释度抗原稀释度抗原稀释度1/101/101/201/201/401/401/801/801/1601/1601/3201/3201/6401/640对照对照1/51/5+1/101/10+1/201/20+1/401/40+1/801/80+当当可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量测定从而检测抗原含量
5、。免疫浊度测定免疫浊度测定（immunoturbidimetryimmunoturbidimetry）原原 理理1.1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量2.2.抗体的质量抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力：特异性强，效价高，亲和力强并使用强并使用R R型抗体型抗体 3.3.抗原抗体反应液的最适抗原抗体反应液的最适PHPH为为6.56.58.5 8.5 4.4.使用增浊剂使用增浊剂免疫浊度测定免疫浊度测定 影响因素影响因素第三节凝胶内沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验 gel phase precipitationgel phase precipitat
6、ion 原理原理 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。烯酰胺凝胶。单向扩散试验单向扩散试验 （平板法）（平板法）single diffusion testsingle diffusion test原理：抗体与待测的抗原原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。结合形成沉淀环。环的大
7、小与抗原的浓度成环的大小与抗原的浓度成正相关。正相关。技术要点：将抗体混入技术要点：将抗体混入0.9%0.9%琼琼脂糖内（脂糖内（50 50），未凝固前倾），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径注成平板，凝固后打孔（直径3 35 5mm mm），孔中加入抗原溶），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿液和不同浓度的标准品，置湿盒内盒内37,2437,244848h h 观察孔周观察孔周围是否出现沉淀环。围是否出现沉淀环。定量试验定量试验单向扩散试验（平板法）单向扩散试验（平板法）倾注平板打孔加样倾注平板打孔加样 放置放置373724244848h h观察沉淀环观察沉淀环 单向扩散试验单向扩散
8、试验 （平板法）（平板法）沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法ManciniMancini曲线：曲线：大分子抗原（大分子抗原（IgMIgM）时间扩散时间扩散4848h h，常数常数K KCdCd2 2普通坐标纸曲线普通坐标纸曲线 FaheyFahey曲线：曲线：小分子抗原（小分子抗原（IgG,IgAIgG,IgA）扩散时间扩散时间2424h h常数常数K KlogCdlogCd 半对数坐标纸曲线半对数坐标纸曲线 C C为抗原浓度，为抗原浓度，d d为沉淀环直径为沉淀环直径T1为1624h；T2为2448h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线
9、t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线ManciniMancini曲线曲线FaheyFahey曲线曲线影响因素：影响因素：抗体质量抗体质量标准曲线标准曲线 ，质控血清，质控血清结果与真实含量不符结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高 双环现象双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分 单向扩散试验单向扩散试验 （平板法）（平板法）单向扩散试验单向扩散试验上排为上排为5 5个不同浓度的参考品；个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右下排为患者血清，下排右2 2为异常为异常病理血清病理血清 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平
10、板法）double diffusion testdouble diffusion test 原理：将抗原抗原理：将抗原抗体分别加在琼脂体分别加在琼脂糖不同的对应孔糖不同的对应孔中，两者在凝胶中，两者在凝胶中自由扩散，在中自由扩散，在比例合适处形成比例合适处形成白色沉淀线。白色沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为孔径为3 3mmmm，孔间距在孔间距在3 35 5 mmmm之之间，在相对的孔中加入抗原或抗间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒体，放置湿盒371837182424h h 后，后，观察孔周围
11、是否出现沉淀环。观察孔周围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）应用应用1.1.抗原或抗体的存在与抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计否以及相对含量的估计 2.2.抗原或抗体相对分子抗原或抗体相对分子量的估计量的估计 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）应用应用3.3.抗原性质的分析抗原性质的分析 双向扩散试验（平板法）应用应用4.4.抗体效价的滴定抗体效价的滴定 5.5.抗原或抗体纯度抗原或抗体纯度的鉴定的鉴定 第四节免疫电泳技术第四节免疫电泳技术immunoelectropho
12、resisimmunoelectrophoresis technique technique 免疫电泳技术免疫电泳技术优点：优点：1.1.加快反应的速度。加快反应的速度。2.2.提高了灵敏度。提高了灵敏度。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。电泳分析电泳分析沉淀反应沉淀反应抗原抗体反应抗原抗体反应的高度特异性的高度特异性电泳技术的高电泳技术的高分辨率、快速、分辨率、快速、微量微量对流免疫电泳对流免疫电泳counter counter immunolectrophoresis,CIEPimmunolectrophoresis,CIEP 原理：双向扩散原理：双向扩散+电泳电泳比双向扩散试验灵比双向
13、扩散试验灵敏度提高敏度提高8 8 1616倍倍技术要点：制备技术要点：制备1.2%1.2%巴比妥巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径孔，孔径3 3mmmm，孔距孔距6 6 mmmm，于阴极侧孔内加待测血清，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条阳性侧孔加抗血清，电泳条件件3 34mA/cm4mA/cm，30min30min1 1h h。对流免疫电泳对流免疫电泳通电通电蛋白质抗原常蛋白质抗原常带较强的负电带较强的负电荷，在电场中荷，在电场中向正极移动向正极移动抗体球蛋白抗体球蛋白带负电荷较带负电荷较少，籍电渗少，籍电渗作用向负极作用向负极泳动泳动 结果分析：结
14、果分析：无沉淀线出现则表明无无沉淀线出现则表明无相应的抗原。相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较中间，说明两者比例较适合。适合。沉淀线偏向抗原孔一方，沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度抗原，表示抗体浓度抗原，反之，则是抗体浓度反之，则是抗体浓度抗原浓度。抗原浓度。对流免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳racket racket immunoelectrophoresis,RIEimmunoelectrophoresis,RIE 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减抗原向正极泳动，随着
15、抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关原量呈正相关 原理原理单向免疫扩散电泳单向免疫扩散电泳,定量检测技术定量检测技术火箭免疫电泳火箭免疫电泳1.2%1.2%巴比妥琼脂糖约巴比妥琼脂糖约5555，加入适量抗，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，样品，样品孔放负极侧，6h
16、6h后观察琼脂后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。样品浓度。技术要点技术要点1.1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。规则。2.2.电泳终点时间的确定。电泳终点时间的确定。3.3.IgGIgG定量时，可用甲醛与定量时，可用甲醛与IgGIgG上的氨基结合（甲上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。酰化），抵消了电渗作用。火箭免疫电泳火箭免疫电泳影响因素影响因素火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳图火箭免疫电泳图为标准抗原；为标本为标准抗原；为标本-+免疫电泳免疫电泳immunoel
17、ectrophoresisimmunoelectrophoresisIEPIEP 原理：区带电泳双向扩散原理：区带电泳双向扩散1 1、将蛋白质抗原在凝胶中、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干电泳分成肉眼不可见的若干区带区带 2 2、沿电泳方向挖一与之平、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散清进行双向扩散 。技术要点：制备琼脂板技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电打孔，加样于孔内，电泳泳2 2 3 3mAmA/cm/cm ，0.50.5 1 1h h后，槽内加入后，槽内加入相应抗血清作双向扩散相应抗血清作双向扩散 免疫电泳免疫电泳纯化抗
18、原和抗体成分的分析及正常和纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素影响因素抗原抗体比例不当抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用，混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率电泳条件直接影响分辨率应用应用免疫电泳示意图免疫电泳示意图-+免疫固定电泳免疫固定电泳immunofixationelectrophoresis,IFEimmunofixationelectrophoresis,IFE 免疫电泳原理，不同之免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳处是将抗血清直接加于电泳后
19、的蛋白质区带表面，抗原后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原反应，在适当位置形成抗原抗体复合物抗体复合物 ，经染色后，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型链进行分型 原理原理区带电泳沉淀反应区带电泳沉淀反应免疫固定电泳免疫固定电泳先将患者血清或血浆在醋纤膜先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将然后将IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、轻轻链和链和轻链的抗血清加于分离轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，
20、参考泳道则加的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相质，染色后则可见被固定的相应应M M蛋白成分。蛋白成分。技术要点技术要点免疫固定电泳示意图免疫固定电泳示意图左图为左图为IgGIgG 型型,中图为中图为IgGIgG 型，右为正常型，右为正常 SP G AM SP G AM SPG AM 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。需数小时，结果易于分析。免疫固定电泳免疫固定电泳应用应用最常用于最常用于M M蛋白的鉴定与分型，也蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与用于尿中本周氏蛋白质的检测与、分型，脑脊液中寡克隆蛋分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。白的检测与分型。优点优点
