1、v种子培养种子培养v 将冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的将冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种工业菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯培养物称为种子。种的过程。这些纯培养物称为种子。一、种子制备原理与技术一、种子制备原理与技术1、优良种子应具备的条件、优良种子应具备的条件生长活力强，延迟期短；生长活力强，延迟期短；生理状态稳定；生理状态稳定；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；无杂菌污染，保证纯种发酵；无杂菌污染，保证纯种发
2、酵；适应性强，生产能力稳定适应性强，生产能力稳定2、种子质量的判断方法、种子质量的判断方法v通常检测的培养液中参数通常检测的培养液中参数pHpH是否在种子要求的范围之内是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染有无杂菌污染 v其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等等 3、种子制备、种子制备v步骤：步骤：斜面培养基中斜面培养基中活化活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培扩大培养养，完成实验室种子制备，完成实验室种
3、子制备一级种子罐一级种子罐，制备生产用种子；视情况，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐种子转种至发酵罐(1)、实验室种子制备、实验室种子制备 v无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。v菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用速，可用固体培养基培养孢子固体培养基培养孢子v菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇摇瓶液体培养法瓶液体培养法v不
4、产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下下活化即可活化即可 e.g 产黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种原始菌种 斜面试管斜面试管 获得孢子获得孢子 250ml 茄子瓶（茄子瓶（大米或小米）大米或小米）25 28 ，414天天 成熟（在真空下抽去水成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在分，使水分含量在10%以下，于以下，于4 冰箱保存）。冰箱保存）。e.g.Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（固体试管斜面（32 C，1824小时）小时）三角瓶
5、培养（摇床）三角瓶培养（摇床）(flask culture)种子罐培养种子罐培养 e.g.yeast：原始菌种（出发菌种）原始菌种（出发菌种）10ml 麦汁试管麦汁试管 250ml 三角瓶培养三角瓶培养 （27 C 28 C，3天）天）（25C，2天）天）510 L卡氏罐卡氏罐（15 C 20 C，35天）天）菌种接入种子罐有两种方法菌种接入种子罐有两种方法孢子进罐法孢子进罐法将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐，可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺子罐，可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点；过程简单、便于控制孢子
6、质量等优点；摇瓶菌丝进罐法摇瓶菌丝进罐法适用于某些生长发育缓慢的放线菌，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，可以缩短种子在种子罐内的培养时间。可以缩短种子在种子罐内的培养时间。（2）、生产车间种子制备）、生产车间种子制备 v实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子种子罐罐进行扩大培养进行扩大培养v种子罐培养：种子罐培养：v一、获得足够的菌种数量，一、获得足够的菌种数量，v二、种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成二、种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵环境分和培养条件，使菌体适应发酵环境 种子罐级数的确定种子罐级数的确定 种子扩大的级数
7、：种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培制备种子需逐级扩大培养的次数养的次数v种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动种子罐生长异常而造成的发酵波动 v但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求以满足发酵的需求 确定方法确定方法菌种的性质菌种的性质(如菌种传代后的稳定性如菌种传代后的稳定性)瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最
8、低接种量发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比种子罐与发酵罐的容积比生产规模生产规模随工艺条件的改变作适当的调整随工艺条件的改变作适当的调整4、种龄与接种量、种龄与接种量v接种龄：接种龄：种子罐中培养的菌体从开始移入种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间下一级种子罐或发酵罐时的培养时间种子培养期应取菌种的种子培养期应取菌种的对数生长期对数生长期为宜，为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。且会降低产量。v大量地接入培养成熟的菌种的优点：大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了缩短生长
9、过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率发酵周期，提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会有利于减少染菌机会放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响 v接种量：接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例的体积的比例 v接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足胞增加等，发酵后劲不足v种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。造成染菌。v以生产菌种在发酵罐中的繁殖速
10、度为依据以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据v接种量的大小直接影响发酵周期。接种量的大小直接影响发酵周期。在放射形土壤杆菌多糖（在放射形土壤杆菌多糖（ARPSARPS）发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响 二、影响种子质量的因素二、影响种子质量的因素p81v原材料质量原材料质量v培养温度培养温度v湿度湿度v通气与搅拌通气与搅拌v斜面冷藏时间斜面冷藏时间v培养基培养基vpHpH1、原材料质量、原材料质量v原材料质量波动引起种子质量不稳定原材料质量波动引起种子质量不稳定v原材料质量波动的主要原因：无机离子原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素含
11、量不同（微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。也会影响孢子的质量）。2、培养温度、培养温度 v温度过低，菌种生长发育缓慢温度过低，菌种生长发育缓慢v温度过高会使菌丝过早自溶温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于在制备土霉素生产种子过程中，高于3737培养时，培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。3、湿度、湿度v湿度低，孢子生长快；湿度低，
12、孢子生长快；v湿度大，孢子生长慢湿度大，孢子生长慢 制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少蒸发呈干瘪状，孢子稀少 4、通气与搅拌、通气与搅拌 v足够的通气量，以保证菌种代谢正足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量常，提高种子的质量 v搅拌可提高通气效果，促进生长繁搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫
13、过液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。多增加染菌机会，增加能耗。v丝状微生物不宜剧烈搅拌。丝状微生物不宜剧烈搅拌。5、斜面冷藏时间、斜面冷藏时间 v对孢子的生产能力有较大影响对孢子的生产能力有较大影响 v冷藏时间越长，生产能力下降越多冷藏时间越长，生产能力下降越多 链霉素生产中，斜面孢子在链霉素生产中，斜面孢子在66冷藏两冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低1818，比冷藏比冷藏3 3个月的降低个月的降低3535。6、培养基、培养基v培养种子的目的：培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健
14、康、活性高的同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。速生长。7、pH v选择最适种子培养选择最适种子培养pHpH的原则是获得的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量最大比生长速率和适当的菌量v培养最后一级种子的培养基的培养最后一级种子的培养基的pHpH应应接近于发酵培养基的接近于发酵培养基的pHpH，以便种子，以便种子能尽快适应新的环境能尽快适应新的环境 三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施P82 v菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退
15、化菌种进行复壮及时对退化菌种进行复壮 v提供适宜的生长环境提供适宜的生长环境v种子无杂菌检查，保证纯种发酵。种子无杂菌检查，保证纯种发酵。种子液生化分析项目主要有：营养基质的消种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、耗速度、pHpH变化、溶氧变化、色泽和气味等变化、溶氧变化、色泽和气味等上节知识回顾上节知识回顾四、种子制备的放大原理与技术四、种子制备的放大原理与技术P82v细菌发酵时的种子扩大培养；细菌发酵时的种子扩大培养；v细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为了细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为了获得大量的活力强的种子获得大量的活力强的种子 ；v种龄对于生芽孢的种子尤其重要。
16、若接种物含大种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期 梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种子扩大培养的程序子扩大培养的程序 举举 例：例：酵母发酵时的种子扩大培养酵母发酵时的种子扩大培养v酿酒酵母的扩大培养酿酒酵母的扩大培养 HansenHansen等最初采用纯种进行酵母发酵并设计等最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为为1010，并控制繁殖条件与酿造时一致，并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为现代的流程中，接种量为1%1
17、%或更低，控制的或更低，控制的条件也与酿造时不同。条件也与酿造时不同。举 例：面包酵母时的种子扩大培养的程序面包酵母时的种子扩大培养的程序 丝状真菌发酵的种子扩大培养丝状真菌发酵的种子扩大培养 丝状真菌既可以利用孢子，也可以丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵行发酵 举举 例：例：在固化的培养基上产生孢子在固化的培养基上产生孢子“滚瓶滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生技术应用于产黄青霉的孢子生产产在固体培养基上产生孢子在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产生孢子在液
18、体深层培养基中产生孢子v （1 1）利用孢子作为接种物）利用孢子作为接种物 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气条件下，培养基中含氮是在通气条件下，培养基中含氮是在0.050.050.10.1（w/vw/v）之间时，可以产生大量的孢子）之间时，可以产生大量的孢子 v(2)(2)利用菌丝体作为接种物利用菌丝体作为接种物 v不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种为接种物，如生产赤霉素的菌种藤仓赤霉藤仓赤霉v问题：难以获得均一的接种物问题：难以获得均一的接种物 v接种前将菌丝打成碎片，形成大量的接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点菌丝段，它具有大量的生长点 放线菌发酵时的种子扩大培养放线菌发酵时的种子扩大培养v斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子v可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子 举举 例：例：作业作业vP273 第五章第第五章第1、5、6
