1、固定化酶法生产-内酰胺类抗生素目 录-内酰胺类内酰胺类抗生素简介抗生素简介固定化酶法生产固定化酶法生产-内酰胺内酰胺类抗生素类抗生素临床应用临床应用-内酰胺类抗生素简介内酰胺类抗生素简介-内酰胺类内酰胺类抗生素是抗生素是一种种类很广的抗生素，其中包括青霉素及其衍生物、一种种类很广的抗生素，其中包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等。头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等。-内酰胺类内酰胺类抗抗生素系生素系指化学结构中具有指化学结构中具有-内酰胺环的一大类抗生素，基本上所有在其分子内酰胺环的一大类抗生素，基本上所有在其分子结构中包括结构中包括-内
2、酰胺核的抗生素均属于内酰胺核的抗生素均属于内酰胺类抗生素，它是现有的抗生内酰胺类抗生素，它是现有的抗生素中使用最广泛的一类，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的素中使用最广泛的一类，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环头霉素类、硫霉素类、单环-内酰胺类等其他非典型内酰胺类等其他非典型-内酰胺类抗生素。此内酰胺类抗生素。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。作用机制作用机制各种各种-内酰胺类抗生素的作用机制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，即内酰胺类抗生素的作用机制均相似，
3、都能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结青霉素结合蛋白，合蛋白，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌细胞细菌细胞壁缺损，菌体膨胀裂解。除此之外，壁缺损，菌体膨胀裂解。除此之外，对对细菌细菌的致死效应还应包括触发细菌的自溶酶活性，缺乏自溶酶的突变株则表现出的致死效应还应包括触发细菌的自溶酶活性，缺乏自溶酶的突变株则表现出耐药性。动物无细胞壁，不受耐药性。动物无细胞壁，不受-内酰胺类药物的影响，因而本类药具有对细菌的选内酰胺类药物的影响，因而本类药具有对细菌的选择性杀菌作用，对宿主毒性小。近十多年来已证实细菌胞浆膜上特殊蛋白择性杀菌作用，对宿主毒性小。近十多年来已证实细菌胞浆膜上特殊
4、蛋白PBPsPBPs是是-内酰胺类药的作用靶内酰胺类药的作用靶位。位。各种细菌细胞膜上的各种细菌细胞膜上的PBPsPBPs数目、分子量、对数目、分子量、对-内酰胺类抗内酰胺类抗生素的敏感性不同，但分类学上相近的细菌，其生素的敏感性不同，但分类学上相近的细菌，其PBPsPBPs类型及生理功能则相似。例如类型及生理功能则相似。例如大肠杆菌有大肠杆菌有7 7种种PBPsPBPs，PBP1APBP1A，PBP1BPBP1B与细菌延长有关，青霉素、氨苄西林、头孢噻吩与细菌延长有关，青霉素、氨苄西林、头孢噻吩等与等与PBP1APBP1A、PBP1BPBP1B有高度亲和力，可使细菌生长繁殖和延伸受抑制，并溶
5、解死亡，有高度亲和力，可使细菌生长繁殖和延伸受抑制，并溶解死亡，PBP2PBP2与细管形状有关，美西林、棒酸与硫霉与细管形状有关，美西林、棒酸与硫霉素能素能选择性地与其结合，使细菌形成大选择性地与其结合，使细菌形成大圆形细胞，对渗透压稳定，可继续生几代后才溶解死亡。圆形细胞，对渗透压稳定，可继续生几代后才溶解死亡。PBP3PBP3功能与功能与PBP1APBP1A相同，但相同，但量少，与中隔形成，细菌分裂有关，多数青霉素类或头孢菌素类抗生素主要与量少，与中隔形成，细菌分裂有关，多数青霉素类或头孢菌素类抗生素主要与PBP1PBP1和（或）和（或）PBP3PBP3结合，形成丝状体和球形体，使细菌发生
6、变形萎缩，逐渐溶解死亡。结合，形成丝状体和球形体，使细菌发生变形萎缩，逐渐溶解死亡。PBP1PBP1，2 2，3 3是细菌存活、生长繁殖所必需，是细菌存活、生长繁殖所必需，PBP4PBP4，5 5，6 6与羧肽酶活性有关，对细菌与羧肽酶活性有关，对细菌生存繁殖无重要性，抗生素与之结合后，对细菌无影响。生存繁殖无重要性，抗生素与之结合后，对细菌无影响。葡萄球菌葡萄球菌 给药后的葡萄球菌给药后的葡萄球菌 固定化酶法生产固定化酶法生产-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素菌种发酵：将产黄青霉菌接种到固体培菌种发酵：将产黄青霉菌接种到固体培养基上，在养基上，在2525下培养下培养7 71010天，即可天，即可
7、得青霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子得青霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气、搅拌，在养基中，通入无菌空气、搅拌，在2727下培养下培养242428h28h，然后将种子培养液接，然后将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空气，搅拌，在培养基中，通入无菌空气，搅拌，在2727下培养下培养7 7天。在发酵过程中需补入天。在发酵过程中需补入苯乙酸前体及适量的培养基。苯乙酸前体及适量的培养基。提取精制提取精制：将：将青霉素发酵液冷却，过滤。青霉素发酵液冷却，过滤
8、。滤液在滤液在pH2pH22.52.5的条件下，于萃取机内的条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入酯萃取液，转入pH7.0pH7.07.27.2的缓冲液中，的缓冲液中，然后再转入丁酯中，将此丁酯萃取液经然后再转入丁酯中，将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素即可得青霉素G G钾盐。青霉素钾盐。青霉素G G钠盐是将钠盐是将青霉素青霉素G G钾盐通过离子交换树脂（钠型）钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得而制得。【天然天然青霉素青霉素】【半合成青霉素半合成青霉素】以以6-6-氨基青
9、霉烷氨基青霉烷酸（酸（6APA6APA）为）为中间体与多种化学合成有机酸进行酰中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。6APA6APA是利用微生物产生的是利用微生物产生的青霉素酰化青霉素酰化酶酶（PGAPGA）裂解）裂解青霉素青霉素G G或或V V而得而得到。酶反应一般在到。酶反应一般在40405050、pH8pH81010的条件下进行；酶固相化技术的条件下进行；酶固相化技术已应用于已应用于6APA6APA生产，简化了裂解工艺过程。生产，简化了裂解工艺过程。6APA6APA也可从青霉素也可从青霉素G G用化用化学法来裂解制得，
10、但成本较高。侧链的引入系将相应的有机酸先用学法来裂解制得，但成本较高。侧链的引入系将相应的有机酸先用氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无机或有机碱为缩合剂，与机或有机碱为缩合剂，与6APA6APA进行酰化反应。缩合反应也可以在裂进行酰化反应。缩合反应也可以在裂解液中直接进行而不需分离出解液中直接进行而不需分离出6APA6APA。青霉素酰化酶青霉素酰化酶(PGA)(PGA)又称为青又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶解酶,在工业上用于大规模生在工业上用于大规模生产产-内酰胺类抗生素中间体内酰胺
11、类抗生素中间体和半和半合成合成-内酰胺类内酰胺类抗生素。抗生素。-内酰胺类抗生素。青霉素酰化酶的产生微生物主要分为革兰氏阳性菌青霉素酰化酶的产生微生物主要分为革兰氏阳性菌(G+)G+)巨大芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、粘结杆粘结杆菌菌、醋酸杆菌等、醋酸杆菌等,及革兰氏阴性菌及革兰氏阴性菌(G-):G-):大肠杆菌大肠杆菌、雷氏普罗威登斯、雷氏普罗威登斯菌、嗜柠檬菌、嗜柠檬酸克鲁沃尔氏菌酸克鲁沃尔氏菌等等,通常革兰氏阳性菌产生的通常革兰氏阳性菌产生的青霉素青霉素酰化酶定位于酰化酶定位于胞外胞外,而革兰而革兰氏阴性菌产生的青霉素酰化酶则分泌于胞内氏阴性菌产生的青霉素酰化酶则分泌于胞内。酶的来源酶的来源日
12、前国内外研究中应用最多的青霉素酰化酶产生菌是大肠杆日前国内外研究中应用最多的青霉素酰化酶产生菌是大肠杆菌和巨大芽孢杆菌。菌和巨大芽孢杆菌。伴随伴随着科技的发展着科技的发展,分子生物学研究的不断创新分子生物学研究的不断创新,涌现出越来涌现出越来越多的基因表达越多的基因表达新技术新技术,重组大肠杆菌的表达系统作为一种重组大肠杆菌的表达系统作为一种表达外源基因的表达系统正日渐被人们表达外源基因的表达系统正日渐被人们熟知并熟知并广泛地利用。广泛地利用。结合代谢工程、融合表达及基因调控等手段结合代谢工程、融合表达及基因调控等手段,定向地对重组定向地对重组大肠杆菌系统大肠杆菌系统的宿主和载体进行合理改进的
13、宿主和载体进行合理改进,使目的基因在大使目的基因在大肠杆菌表达系统上的表达水平及肠杆菌表达系统上的表达水平及产物产物蛋白的活性显著提高。蛋白的活性显著提高。因而因而,重组大肠杆菌表达系统具有投入成本低重组大肠杆菌表达系统具有投入成本低,表达产物表达产物周期周期短短,培养方法简单培养方法简单,遗传背景明确等其他菌种表达系统所无法遗传背景明确等其他菌种表达系统所无法比拟的比拟的优点优点。选择重组表达选择重组表达系统系统青霉素酰化酶在偏碱性环境下青霉素酰化酶在偏碱性环境下,可催化青可催化青霉素霉素G水解制备生产半水解制备生产半合成合成-内酰胺内酰胺类类抗抗生素所需生素所需的关键中间体的关键中间体6A
14、PA和和7-ADCA，两者两者又可在酰化酶的催化下分别生成青霉又可在酰化酶的催化下分别生成青霉素和素和头孢菌素。头孢菌素。有有研究表明研究表明,游离的青霉素游离的青霉素酰化酶酰化酶的最适作用的最适作用条件为条件为28,0.02m/LpH8.1磷酸缓冲溶液。磷酸缓冲溶液。但由于游离酶对环境变化的耐受力极低但由于游离酶对环境变化的耐受力极低,大大大大限制了该酶的规模化限制了该酶的规模化应用应用,固定化酶固定化酶应运而生。应运而生。固定化酶具有游离酶无法比拟的优势固定化酶具有游离酶无法比拟的优势,它对温它对温度、度、pH值、溶剂极性等具有极高的耐受性值、溶剂极性等具有极高的耐受性,并能反复回收使用。
15、并能反复回收使用。如何有效固定青霉素酰化酶是酶促工艺的核心技术如何有效固定青霉素酰化酶是酶促工艺的核心技术,载体材料载体材料的选择与制备是技术的关键。的选择与制备是技术的关键。国内外国内外利用利用吸附法、共价结合法、交联法和包埋法吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等方法对青霉素酰化等方法对青霉素酰化酶进行固定酶进行固定,目前应用目前应用和报道得最多的一类方法是和报道得最多的一类方法是共价结合法共价结合法。共价结合法：将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰共价结合法：将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体的环氧基化酶通过共价键结合到聚合物载体的环氧基团上团上,获得高活力的固定化青霉素酰化酶
16、。该获得高活力的固定化青霉素酰化酶。该酶的最适酶的最适pH8.0,pH8.0,最适温度达到最适温度达到55,55,在在pH6.0-pH6.0-8.58.5、温度低于、温度低于4040的条件下的条件下,使用使用200200批次后批次后该酶的活力仍保留该酶的活力仍保留80%80%左右左右,但这种酶的缺点但这种酶的缺点是副产物苯乙酸对其抑制增大。是副产物苯乙酸对其抑制增大。微生物获取微生物获取细胞破碎细胞破碎粗酶液制备粗酶液制备酶酶的分离纯的分离纯化化酶浓缩结晶酶浓缩结晶酶存储酶存储酶的固定化酶的固定化空气除菌空气除菌产品产品粗产品分离粗产品分离提纯提纯原料预处理原料预处理酶反应器酶反应器制备工艺制备工艺临床应用临床应用好，同学们，下课了
