1、血流感染的早期诊断与病原菌识别血流感染的早期诊断与病原菌识别10101020203030404 血流感染的定义、诊断及流行病学 早期诊断与病原菌识别的方法-血培养相关问题早期诊断与病原菌识别-感染标志物相关问题 早期诊断与病原菌识别-分子生物学检测相关问题目目 录录 2血流感染定义（血流感染定义（BSI）败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染性疾病，病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。血流感染（bloodstream infe
2、ction,BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。3血流感染的诊断标准（血流感染的诊断标准（2001年卫生部颁布年卫生部颁布）4血流感染诊断标准（血流感染诊断标准（1996美国疾病控制与预防中心）美国疾病控制与预防中心）血培养 1 次或 1 次以上阳性,阳性病原体与其他感染部位无关。患者至少有以下 1 项症状或体征:发热(38 )、寒战或低血压,同时至少满足以下任意 1 项:若血培养为常见的皮肤寄植菌需有不同时间 2 次或 2 次以上的血培养阳性。若血培养为上述常见皮肤寄植菌,血培养仅 1 次阳性则需同时有静脉导管培养为阳性的同一病原菌且已开始正确的抗微生物治疗。血抗原测定阳性,且症状、
3、体征、实验室结果不能用其他部位的感染来解释5血流感染流行病学资料血流感染流行病学资料全球：全球：18001800万病例万病例 美国：确诊病例美国：确诊病例130130万万 欧洲和日本：确诊病例欧洲和日本：确诊病例190190万万每年治疗费用：每年治疗费用：167167亿美金美国亿美金美国 6767亿美金欧洲亿美金欧洲 导致死亡病种排名第十位导致死亡病种排名第十位 每年导致大约每年导致大约4040万人死亡万人死亡 败血症在败血症在1010年间增加了年间增加了139139 非心内非心内ICUICU病区最常见的死亡病因病区最常见的死亡病因 在在130130万病例中，有万病例中，有7878万例发生在万
4、例发生在ICUICU病病区区Crit Care Med 2001;29:1303-106国内血流感染的病死率国内血流感染的病死率结论：普通住院患者BSI的病死率为20.7%，烧伤、血液病肿瘤以及ICU患者病死率更高，而新生儿病房、肝病及糖尿病患者则相对较低。医院BSI 病死率为26.8%，明显高于社区BSI的病死率。近几十年来，BSI住院病死率呈下降趋势。7病死率临床表现血培养治疗问题 血流感染血流感染病情凶险，病情凶险，死亡率高达死亡率高达26-41%26-41%阳性率低，阳性率低，培养结果所培养结果所需时间长需时间长（2-52-5天）天）临床表现缺临床表现缺乏特异性，乏特异性，诊断困难诊断
5、困难 不恰当的经不恰当的经验性治疗易导验性治疗易导致细菌耐药及致细菌耐药及医疗资源浪费医疗资源浪费 血流感染早期诊断治疗存在的问题血流感染早期诊断治疗存在的问题8早期诊断与病原菌识别的主要方法早期诊断与病原菌识别的主要方法 快速检测方法，包括原位分子杂交、聚合酶链反应、基因芯片、质谱技术等 针对免疫和炎症反应的指标;包括TNF-a、PCT、IL-6、CRP、乳酸及内毒素等，特异性差 血培养血培养分子生物分子生物学检测学检测感染标志感染标志物检测物检测血流感染诊断的金标准，但阳性率低，检测周期长（3-7天）9血流感染的血培养方法血流感染的血培养方法临床细菌/真菌检测常用的方法生化表型全自动微生物
6、鉴定/药敏分析系统10血培养研究血培养研究 对2004年1月-2005年12月入住Robert Wood Johnson大学附属医院及Duke大学医疗中心且血培养阳性的成人患者进行回顾性分析，患者在24h内均接受 3次血培养 研究旨在评估血培养次数与阳性率的相关性Lee A et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546354811单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率 24小时血培养次数3次或4次的患者，前两次血培养的阳性率99%阳性率Lee A et al.JOURNAL OF CLINI
7、CAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546354812混合感染：多次血培养可提高阳性率混合感染：多次血培养可提高阳性率 研究期间，共发生58例由多种病原体导致的血流感染，该类患者前三次血培养的阳性率为100%阳性率N=58例Lee A et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546354813病原体血培养的阳性率与采血体积相关病原体血培养的阳性率与采血体积相关 导致血流感染的G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关阳性率标准体积：采血量为7-10ml,平均8.7ml;低体积：采血量2.
8、455微克/L,诊断G-菌BSI的敏感度为71.4%，特异度96.2%。在G+菌血流感染所致脓毒症患者，PCT的AUC为0.619，最佳诊断临界值1.585微克/L,敏感度41.2、特异度82 诊断细菌性BSI时，血浆PCT的敏感性和特异性较血清CRP、血浆内毒素明显增高结论结论：G-菌血流感染所致脓毒症患者PCT、CRP、内毒素水平高于G+菌血流感染者，三者联合检测有望成为早期判断血流感染所致脓毒症及其病情严重程度的指标。23分子生物学指标监测分子生物学指标监测聚合酶链反应（PCR）荧光原位杂交技术基因芯片技术质谱技术24一、荧光原位杂交技术（一、荧光原位杂交技术（FISHFISH）核酸杂交
9、技术核酸杂交是指具有一定互补序列的2条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形成同源或异源双链分子的过程。核酸杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的2条条单链之间进行。其中，荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（FISHFISH）应用于临床实验室鉴定工作已有10余年，其检测的敏感性和特异性可达到96-100%25血培养阳性血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交核酸荧光原位杂交血培养阳性肉汤 革兰染色 PNA FISH革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌报道Salmonella spp.90min PNA
10、 FISH完成Appl Environ Microbiol.2010;76:4476 J.Clin.Microbiol.2013,51(4):1301J Clin Microbiol.2009;47:247 26荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术-细菌细菌早期识别早期识别新的荧光原位杂交技术对血培养阳性快速病原体识别 结果显示：152例患者血培养阳性的个标本中，FISH鉴定细菌生长的阳性例标本数145个。在病原菌鉴别中138例准确，7例错误，微生物识别准确率95.2%,可信区间95%。在需氧菌和厌氧菌的鉴别没有差异。对血培养阳性病原菌鉴别时间为30分钟，上机时间仅需10分钟。结论：荧光原位杂交技
11、术对于血流感染的快速诊断和病原菌精确识别具有重要的临床意义27荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术-真菌真菌早期识别早期识别对照性研究通过对疑似侵袭性真菌感染患者血培养和脑脊液中病原体的检测，以评价FISH技术的诊断价值。28荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术-真菌真菌早期识别早期识别在112份脑脊液标本中，FISH检测真菌的阳性率稍高于传统墨汁染色显微镜检测值（48/46），且阳性结果敏感性和特异性均为100%。对血标本中病原菌的鉴别能力传统方法、PCR-RFLP及FISH没有差异（14/30）血培养确定微生物生长后进行病原菌识别的平均时间有明显差异，传统显微镜识别、PCR-RFLP及FISH分别
12、为6天、12小时和5小时结论：荧光原位杂交技术在侵袭性真菌感染的病原菌识别方面具有重要价值29二、基因芯片技术二、基因芯片技术基因芯片(gene chip)基因芯片也称DNA微阵列，可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片检测基本原理是将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测DNA标本进行杂交反应，从而获得需要的生物学信息。液相基因芯片是近年来发展出的一种新的芯片技术，与固相芯片相比，液相芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性商品化基因芯片血流感染病原体检测均应用于阳性血培养物（血培养阳性病原菌鉴定）30 结
13、果：标本病原菌识别率为86%（1807/2017），敏感率为94.7%（95%CI），特异性为98.8%。而对MRSA的特异性为100%。病原菌检测时间仅需18小时 结论：基因芯片技术对细菌种类进行最终鉴定具有较传统血培养敏感性高、特异性强及时间更短的特点。有利于临床脓毒症快速诊断和早期治疗。基因芯片技术对血培养阳性标本进行细菌种类准确、快速鉴定的一项观察性研究对英国和芬兰两个医学中心3318例疑似脓毒症患者的2107份血培养阳性标本用新型的PCR扩增和基因芯片技术检测鉴定血标本中病原菌，并与常规的细菌培养方法对照31三、质谱技术三、质谱技术 质谱(mass spectrometry,MS)技
14、术，尤其是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，具有简便、快速及特异地分析微生物大分子标记物质谱图，从而实现临床微生物检验中细菌、真菌及病毒在属、种、株水平上的鉴定。MS 在菌血症、尿路感染、毒素检测及耐药监测方面显示出巨大的优势，有望成为临床微生物实验室感染性疾病常用诊断方法 弗朗西斯阿斯顿于1919年制成的第一台质谱分析仪，1922年诺贝尔化学奖32MALDI-TOF MS操作步骤操作步骤33MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养快速鉴定阳性血培养使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTE
15、C(BD):正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%)80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux):388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌）15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌Clin Microbiol Infect 2010;16:1631J Clin Microbiol 2010;48:154234MALDI-TOF MSVITEK MS(bioMrieux)以16s为金标准
16、，980株临床分离株，ID正确率 肠杆菌科97.7%非发酵菌92%葡萄球菌属94.3%链球菌属84.8%HACEK84%酵母菌85.2%J Clin Microbiol.2010;48:90035四、聚合酶链反应（PCR）核酸扩增及DNA序列分析PCR是一种体外核酸扩增技术。目前,PCR已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方法。PCR在血流感染微生物检测和鉴定中的应用体现在3个方面：一是对纯的病原菌鉴定；二是对血培养阳性培养物快速鉴定；三是对临床标本中难以培养病原菌进行检测和鉴定。可通过2种方式检测和鉴定病原微生物，一是使用特异引物扩增检测病原微生物目标基因；二是使用通用引物扩增检测细菌16
17、SrRNA和真菌 ITS及5.8S、26SrRNA等基因D1/D2序列，同时进行测序分析Kary B.MullisThe Nobel Prize in Chemistry 199336阳性血培养基于阳性血培养基于PCRPCR的检测的检测PCR特异性检测 病原特异性PCR 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA,肠球菌van 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测：PCR扩增特定靶位 多态性分析 测序 后续基因检测 种特异性real-time PCRExpert Opin.Med.Diagn.2012,6(3):209.Curr Opin Infect Dis.2011,24(2):
18、13737保守区反应亲缘性可变区反应菌种间差异广谱性细菌广谱性细菌/真菌感染核酸检测真菌感染核酸检测-临床应用检测方法：核酸检测 16s rDNA/18s rDNA-“细菌/真菌身份证”(每个细菌/真菌都有的一个基因)38 不明微生物感染病原体广谱检测检测方法：PCR+ABI 3730 xl 测序法类型报告周期样本采集细菌感染检测1天内标本要求：痰液、肺泡灌洗液等真菌感染检测结核杆菌检测检测检测内容内容39细菌细菌16s/真菌真菌18s 检测检测 16s rDNA/18s rDNA-“细菌/真菌身份证”临床细菌/真菌检测常用的方法细菌/真菌培养生化表型检测确定菌种基因检测基因检测病原体培养病原
19、体培养检测时间检测时间3-53-5天天(最快最快18h)18h)3-73-7天，阴性结果天，阴性结果2 2个月个月灵敏度灵敏度10-100 copies10-100 copies1010*5 copies5 copies特异度特异度可区分可区分10001000种菌种菌350350种菌种菌局限性局限性100100个菌为阴性个菌为阴性苛氧菌，厌氧菌不易培养；不能早期诊断苛氧菌，厌氧菌不易培养；不能早期诊断技术条件要求技术条件要求PCRPCR扩增扩增无菌无菌3737培养箱与显微镜培养箱与显微镜临床意义临床意义确定感染确定感染怀疑感染怀疑感染细菌16S分型“细菌分型的金标准”40聚合酶链式反应检测诊断
20、血流感染聚合酶链式反应检测诊断血流感染1Critical Care Medicine 2015目的：选择欧洲6个国家共9个ICU529名重症感染患者所采集的标本进行血培养和分子生物学检测，其中包括616份血流感染、185份肺炎及110份无菌区液体或组织的样本，评价聚合酶链反应检测方法的潜在临床意义分子检测技术用于血流感染、肺炎及无菌部位分子检测技术用于血流感染、肺炎及无菌部位感染的危重病人快速诊断的多中心研究感染的危重病人快速诊断的多中心研究41聚合酶链反应检测诊断血流感染聚合酶链反应检测诊断血流感染1在625份血流感染标本中，PCR鉴定病原菌228例（37%），而血培养为68例（11%）。P
21、CR的灵敏度为81%，特异性为69%，阴性预测值为97%。Critical Care Medicine 201542聚合酶链反应检测诊断血流感染聚合酶链反应检测诊断血流感染1结论：聚合酶链反应/电喷雾质谱检测（PCR）技术可以作为血流感染快速识别病原菌的方法，6小时内排查血流感染，具有潜在的临床经济效益Critical Care Medicine 201543多重聚合酶链反应诊断血流感染多重聚合酶链反应诊断血流感染2一项对照性研究，对263例疑似脓毒症患者血标本进行血培养和多重PCR技术，检测标本中细菌和真菌病原体，对两种检测方法的检测率、敏感性、特异性及分层状况下的结果进行对照分析，评价多重
22、PCR技术的临床应用价值。44研究结果显示在该研究263份病例中，确诊感染41.5%，可能感染30.7%，余为无感染 以临床表现作为参考标准时两种检测方法敏感性30%、NPV19%均低，而以血培养作为参考标准时，PCR检测的敏感性61%、特异性95%、NPV90，PPV76%在病原菌的鉴别数量方面血培养高于PCR（66/46），但对于血培养阴性的病例中PCR技术更显优势在预先使用过抗生素的病例中，血培养检测阳性率高于PCR技术检测时间PCR技术明显优于血培养45小小 结结血流感染的早期诊断和病原菌识别是减少细菌耐药、降低死亡率前提优化血培养提高BSI的诊断阳性率感染标志物仅是反映BSI严重程度的重要指标分子生物学技术对BSI早期诊断和病原菌识别具有重要的临床价值分子生物学技术不能替代血培养46谢谢聆听！47
