1、第第11章章 荧光分析法荧光分析法 Molecular fluorometry11.1 概概 述述荧光：荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法：荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。进行物质鉴定和含量测定的方法。荧光分析法的优点荧光分析法的优点：灵敏度高、选择性好灵敏度高、选择性好第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级分子荧光分析法分子荧光分析法（molecular fluorometry
2、）自旋量子数自旋量子数s=1/2或或-1/2总自旋量子数总自旋量子数 S0多重性多重性 2S1111.2 基本原理基本原理基态基态单重态单重态激发激发单重态单重态激发激发三重态三重态荧光和磷光产生示意图荧光和磷光产生示意图吸收吸收振动振动驰豫驰豫内部能量转内部能量转换换荧光发射荧光发射体系间体系间跨越跨越磷光发射磷光发射振动驰豫振动驰豫内部能量转换内部能量转换处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。态的最
3、低振动能级的过程。当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。无辐射跃迁无辐射跃迁关于荧光关于荧光荧光的产生需经历两个过程：荧光的产生需经历两个过程：吸收吸收发射发射第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级振动驰豫振动驰豫内部能量转换内部能量转换 例例 题题1.所谓荧光，即某些物质经入射光照射后，所谓荧光，即某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光：光：A 波长长
4、的光线波长长的光线 B 波长短的光线波长短的光线 C 能量大的光线能量大的光线 D 频率高的光线频率高的光线 11.2.2 激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱 1.激发光谱：激发光谱：excitation spectrum荧光光谱荧光光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。波长荧光的相对效率。2.发射光谱：发射光谱：fluorescence/emission spectrum F exF-em表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光光谱的特征荧光光谱的特征（1）斯托克斯位移（）斯托
5、克斯位移（Stokes shift）：）：em ex产生原因：产生原因：能量损失能量损失（1）内转换和振动驰豫）内转换和振动驰豫（2）激发态分子返回基态不）激发态分子返回基态不同振动能级同振动能级（3）激发态分子与溶剂分子）激发态分子与溶剂分子的相互作用的相互作用荧光光谱的特征荧光光谱的特征（2）荧光光谱的形状与激发波长无关）荧光光谱的形状与激发波长无关产生原因：产生原因：荧光发射是从特定的激发态返回基态荧光发射是从特定的激发态返回基态荧光光谱的强度与激发波长有关荧光光谱的强度与激发波长有关荧光光谱的特征荧光光谱的特征（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系）荧光光谱与激发光谱的镜像关系产生原因：产
6、生原因：电子基态的振动能级电子基态的振动能级分布与激发态的相似分布与激发态的相似 例例 题题下列说法哪个是错误的？下列说法哪个是错误的？A 荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 B 荧光波长总是大于激发光波长荧光波长总是大于激发光波长 C 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应相对应 D 最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应 11.2.3 分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：1.强的紫外可见吸收强的紫外可见吸收2.一定的荧光效率
7、一定的荧光效率 荧光效率（荧光量子产率）荧光效率（荧光量子产率）吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数发射荧光的光子数发射荧光的光子数 f1.荧光效率荧光效率 f 01 2.分子结构对荧光效率的影响分子结构对荧光效率的影响分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：1.强的紫外可见吸收强的紫外可见吸收2.一定的荧光效率一定的荧光效率长共轭结构长共轭结构分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性取代基作用取代基作用ex 205nm 286nm 356nmem 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36 （1）长共轭结构）长共轭结构结论：结论：电子共轭程度越大
8、，荧光强度（荧电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，荧光波长长移光效率）越大，荧光波长长移联苯联苯f 0.2 芴芴f 1.0 CH2NOHNOMg1/2（2）分子的刚性和共平面性）分子的刚性和共平面性SO3NaNCH3CH3SO3NaNCH3CH3CHCHHCHC结论：结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移2、分子的刚性和共平面性、分子的刚性和共平面性（3）取代基作用）取代基作用给电子基团给电子基团吸电子基团吸电子基团与电子体系相互作用较小的取代基与电子体系相互作用较小的取
9、代基NH2、OH、OCH3、NHR、NR2荧荧光效率提高、荧光波长长移光效率提高、荧光波长长移COOH、NO2、CO、NO、卤素、卤素荧光效率减弱甚至熄灭荧光效率减弱甚至熄灭 例例 题题关于荧光效率，下面错误的叙述是：关于荧光效率，下面错误的叙述是：A 具有长共轭的具有长共轭的*跃迁的物质具有较大的荧光跃迁的物质具有较大的荧光效率效率 B 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大 C 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D 共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响也不同响也不同 11.2.
10、4 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素温度温度溶剂溶剂pH荧光熄灭荧光熄灭散射光散射光学习目的学习目的:提高荧光分析的灵敏度和选择性提高荧光分析的灵敏度和选择性1.温度温度荧光素钠的乙醇溶液在下列哪种条件下荧光强度最强？荧光素钠的乙醇溶液在下列哪种条件下荧光强度最强？A 0 B -10 0 C -20 0 D -30 0 1.一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低。质的荧光效率和荧光强度将降低。2.原因原因:温度升高时温度升高时，分子运动速度加快分子运动速度加快，分子分子间碰撞几率增加间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增
11、加使无辐射跃迁增加，从而降低从而降低了荧光效率了荧光效率2.溶剂溶剂萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？A 1氯丙烷氯丙烷 B 1溴丙烷溴丙烷 C 1碘丙烷碘丙烷 D 1，2二氯丙烷二氯丙烷 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强。荧光强度也增强。2.原因原因:在极性溶剂中，在极性溶剂中，的能量差的能量差小小 跃迁*3.pH的影响的影响苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？A pH1 B pH3 C pH13 D pH10 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸当荧
12、光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡的改变。酸度中分子和离子间的平衡的改变。4.荧光熄灭的影响荧光熄灭的影响 荧光熄灭，又称荧光猝灭，是指荧光物质分子荧光熄灭，又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而引起荧光强度与溶剂分子或溶质分子的相互作用而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象（1）选择合适的溶剂）选择合适的溶剂（2）溶液浓度在合适的范围）溶液浓度在合适的范围5.散射光的干扰散射光的干扰散射光散射光选择适当的激发波长消
13、除拉曼光选择适当的激发波长消除拉曼光的干扰的干扰瑞利光瑞利光拉曼光拉曼光11.3 定量分析方法定量分析方法Quantitative analysis of fluorometry11.3.1 荧光强度与荧光物质浓度的关系荧光强度与荧光物质浓度的关系I)K(IF0 !3)ECl3.2(!2)ECl3.2(ECl3.2I KF320 EClI K3.2F05.0ECl0 时时，ECl010II IFI0KC 1.观测方向观测方向:与激发光源垂直与激发光源垂直2.原因原因:消除透射光的影响消除透射光的影响关于灵敏度的问题关于灵敏度的问题KcEclI K3.2F0EclIIlgA0 紫外可见紫外可见:
14、10-5荧光荧光:10-7csFsF0FxF0cx11.3.2 定量分析方法定量分析方法1、标准曲线法、标准曲线法11.3.2 定量分析方法定量分析方法2、比例法（对照法）、比例法（对照法）s0sKCFF x0 xKCFF s0s0 xxCFFFFC 例例 题题在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方向上进行测量，这是由于：的方向上进行测量，这是由于：A 荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响的影响B 只有在与入射光成直角的方向上，才有荧光只有在与入射光成直角的方向上，才有荧光C 荧光强度比透射光强度小荧光
15、强度比透射光强度小 D 荧光的波长比入射光波长长荧光的波长比入射光波长长11.4 荧光分析技术及应用荧光分析技术及应用光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发发 射射单色器单色器检测器检测器 1.光源光源 2.单色器：单色器：3.样品池：样品池：4.检测器：检测器：荧光分光光度计的主要部件荧光分光光度计的主要部件氙灯：氙灯：波长范围波长范围250700nm，300400nm谱线谱线强度几乎相等强度几乎相等光电倍增管光电倍增管激发单色器、发射单色器激发单色器、发射单色器石英、四面透光石英、四面透光3、作用、作用1、荧光试剂（荧光探针）、荧光试剂（荧光探针）2、化学物质、化学物质（1）提高测定的灵敏度和选择性）提高测定的灵敏度和选择性（2）扩大荧光分析法的应用范围）扩大荧光分析法的应用范围11.4.2 应用与示例应用与示例（1）荧光胺）荧光胺（2）邻苯二甲醛）邻苯二甲醛（3）丹酰氯）丹酰氯
