1、 单个核细胞的分离单个核细胞的分离实验目的 1熟悉免疫细胞分离的常用方法。2掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。免疫系统免疫系统 免疫器官免疫器官 免疫细胞免疫细胞 免疫分子免疫分子外周血细胞成分外周血细胞成分淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞粒细胞粒细胞红细胞和血小板红细胞和血小板不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 血小板：血小板：1.0301.035细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞
2、密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同人外周血单个核细胞（人外周血单个核细胞（peripheral blood peripheral blood mononuclear cellmononuclear cell，PBMCPBMC）包括淋巴细胞和单）包括淋巴细胞和单核细胞核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。是免疫学实验中常用的细胞群。【实验原理】人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.0751.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque 比重比重 1.0770.0
3、01）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。Ficoll分层液分层液 聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺:商品名为商品名为Ficoll,其密度为其密度为1.0770.001。主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。种单次差速密度梯度离心的分离法。其主要成分其主要成分:2份浓度为浓度为6、密度为密度为1.020 g/L聚蔗糖聚蔗糖(商品名为商品名为Ficoll)与与1份浓度为浓度为34、密度为密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶液混合。泛影葡胺水溶液混合。用用1.0771.0770
4、.0010.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 密度梯度离心密度梯度离心(FicollFicoll)离心离心试剂与器材试剂与器材 1.标本标本 外周静脉血加外周静脉血加EDTA-K2抗凝，或抗凝，或1000U/ml肝素抗凝血。肝素抗凝血。2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重泛影葡胺，比重(1.0770.001）有商品供应。）有商品供应。3.Hanks液液 4.台盼蓝染液台盼蓝染液 5.器材器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。操作方法操作方法 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然取静脉血放入抗凝管，摇匀
5、，先作白细胞计数，然后取后取1.5ml加入等量加入等量Hank液，混匀。液，混匀。2.取取1.5ml Ficoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为例为1：2），二者之间有一明显的界面。），二者之间有一明显的界面。3.用水平离心机以用水平离心机以2000r/min离心离心20min，离心离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中
6、间层为分离液，底层为红细胞和多形板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层浑浊的单个核细胞层 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入吸取该层单个核细胞，移入EP管，管，2000r/min 5min离心去血浆，离心去血浆，加加 1mlHanks混匀，混匀，2000r/min离心离心5min，弃上弃上清液清液。5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用用Hanks还原至还原至1ml，取一滴细胞悬液置
7、血细取一滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。100%单个核细胞回收率单个核细胞回收率=分离后细胞悬液分离后细胞悬液ml每毫升单个核细胞数每毫升单个核细胞数 全血全血ml数数全血中每毫升单个核细胞数全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数单个核细胞数1毫升细胞悬液毫升细胞悬液)4个大方格内细胞总数个大方格内细胞总数10 1032(稀释倍数稀释倍数)46.细胞活力检测细胞活力检测 取取2滴细胞悬液与滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率细胞活力百分率=蓝色细胞数
8、蓝色细胞数/100个单个细胞个单个细胞数数结果判断结果判断 活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在活细胞应在95%以上以上。实验讨论实验讨论 1.注意事项将稀释的血液加分层液上注意事项将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。或与分层液混合影响分离结果。分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要分离人和不同种类动物外周单个核血
9、细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以的比重以1.0771.0770.000.001 1为好；小鼠为为好；小鼠为1.088,1.088,而而马则为马则为1.0901.090。配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性有缓冲作用，并对细胞无毒性方法评价方法评价 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，方法，用该方法不能除去其中的单核细胞。用该方法不能除去其中的单核细胞。临床意义临床意义 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
