1、 流式细胞术在血液病中的应用The Art and Science of Flow Cytometry Ionomycin0 minutes 5 流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometer,FCM or FACS）是一项集激光技术、流体力学是一项集激光技术、流体力学技术、光电测量技术、计算机技术以及细技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。的新型高科技仪器。流式细胞术流式细胞术使制备合格的单细胞或粒子使制备合格的单细胞或粒子悬液高速流过一个光学和电子传导特别敏悬液高速流过一个光学和电子传导特别敏感区，
2、使其产生一组光学和电子信号，然感区，使其产生一组光学和电子信号，然后在各种特定电子软件中对这些信号进行后在各种特定电子软件中对这些信号进行定性、定量分析，获取被检细胞或颗粒的定性、定量分析，获取被检细胞或颗粒的各个生物学信息和特征。各个生物学信息和特征。Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid 特特 点点（5）分选）分选（1）测量速度快）测量速度快（2）高灵敏度）高灵敏度（3）高分辨率和精确度）高分辨率和精确度（4）多参数）多参数基基 本本 结结 构构 光学系统光学系统 信号转换和电路系统信号转换和电路系统 数据储
3、存、显示和分析系统数据储存、显示和分析系统（5）分选系统）分选系统 流动系统流动系统流式细胞仪的主要技术指标流式细胞仪的主要技术指标1.荧光测量灵敏度荧光测量灵敏度2.2.仪器的分辨率和准确度仪器的分辨率和准确度3.3.前向角散射光检测灵敏度前向角散射光检测灵敏度4.4.检测速度以每秒可分析的细胞数来表示检测速度以每秒可分析的细胞数来表示5.5.FCMFCM分选指标主要包括：分选速度、分选纯分选指标主要包括：分选速度、分选纯 度、分选后细胞的活性度及分选收获率。度、分选后细胞的活性度及分选收获率。流式细胞仪可测量的主要参数流式细胞仪可测量的主要参数细胞结构细胞结构=细胞大小=细胞粒度=细胞表面
4、面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面/胞浆/核的特异性抗原=细胞活性=细胞内细胞因子=酶活性=激素结合位点=细胞受体 影响信号的因素影响信号的因素 1 细胞的荧光染色细胞的荧光染色：细胞对荧光染料分子的亲合性是否一致、细胞结合的荧光分子量、染色的浓度、时间、温度、pH值、细胞数等。2 激光光源的稳定性。激光光源的稳定性。3 细胞流速的稳定性细胞流速的稳定性。4 细胞悬液样品的质量细胞悬液样品的质量：细胞粘连、重叠、杂质过多等。=数据存储数据存储:LIST MODE=数据显示数据显示:直方图(Histogram)二维点图(Dot Plot)等高线
5、图(Contour Plot)密度图(Density)假三维图Log FITC 1000 100 10 1 110.1Count 30 700 150ImmunophenotypingImmunophenotypinguSingle Parameter Histogram:Count vs MFI单参数如单参数如 FSC 或或 FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量。处在同一通道的每一细胞均符纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强
6、合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。双双 参参 数数 图图外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）双参数可在二维散点图中同时显示，双参数可在二维散点图中同时显示，X 轴显示通道轴显示通道 1（FL1），），Y 轴轴显示通道显示通道 2（FL2）。）。3-D Histograms（假）三维图由（假）三维图由X、Y、Z三个数轴组成，三个数轴组成，X 轴显示通道轴显示通道 1信号信号（FL1），），Y 轴显示通道轴显示通道 2信号（信号（FL2），），
7、Z轴显示通道轴显示通道3信号信号（FL3）或其他两个通道的细胞数量。）或其他两个通道的细胞数量。设设 门门 选择特定细胞亚群进行检测和分析的方法选择特定细胞亚群进行检测和分析的方法称为称为设设 门门 分析分析(Gating analysis)(Gating analysis)。设。设 门门 可以是单参数设可以是单参数设 门门,也可以是双参数也可以是双参数设设 门门，通过设门的方法可以定义细胞亚，通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域，并可调出该区域细胞其他参数群的区域，并可调出该区域细胞其他参数的相关信息的相关信息,被调出的信息同样也可以是被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。单参数和双参数。
8、应用流式细胞术的基本步骤应用流式细胞术的基本步骤1 首先制备出合格的单细胞悬液首先制备出合格的单细胞悬液2 对感兴趣的细胞生物化学成分进行特殊染对感兴趣的细胞生物化学成分进行特殊染色色3 上机测量，采集数据上机测量，采集数据4 对收集、储存的数据进行定性、定量分析对收集、储存的数据进行定性、定量分析5 从生物医学方面对分析结果予以解释从生物医学方面对分析结果予以解释流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用=HIV免疫分型，CD4绝对计数=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤细胞的周期和倍体分析=网织红细胞和网织血小板计数=移植前的交叉配型和免疫状态免疫状态监测=干细胞计数=微
9、小残留白血病细胞检查（MRD）=HLA-B27检查，CD55，CD59,CD64=血小板功能及相关疾病白血病免疫分型白血病免疫分型l 诊断诊断：确定急性白血病细胞性质的准确率高达确定急性白血病细胞性质的准确率高达90%以以上；上；发现特殊类型的白血病，如变异型、混合型、发现特殊类型的白血病，如变异型、混合型、M6、M7等；等；了解了解ALL的亚型和分期。的亚型和分期。l 治疗治疗：帮助临床推测预后、根据患者危险系数选择最佳：帮助临床推测预后、根据患者危险系数选择最佳或制定个体化的治疗方案。或制定个体化的治疗方案。l跟踪治疗效果、预防复发跟踪治疗效果、预防复发：为检测微小残留病变（：为检测微小残
10、留病变（MRD）建立基础。建立基础。免疫表型依据免疫表型依据:1.淋巴细胞某一亚群的扩增淋巴细胞某一亚群的扩增 2.Ig轻链缺失轻链缺失(单克隆单克隆),TCR单克隆单克隆3.异常抗原表达：强度异常抗原表达：强度/缺失缺失/穿越穿越/异常共异常共表达表达4.细胞形态细胞形态病例1 患者女，患者女，6262岁，双眼及鼻腔反岁，双眼及鼻腔反复流脓复流脓2 2年余，加重年余，加重3 3个月，并个月，并出现咽喉部疼痛。出现咽喉部疼痛。外周血免疫分型外周血免疫分型 PB免疫分型报告：发现一群异常细胞，免疫分型报告：发现一群异常细胞，约占全部有核细胞的约占全部有核细胞的90%，表型为，表型为CD2+CD3
11、+CD5+CD7+CD8+CD20+CD4-CD10-CD19-CD45+,提示提示T 细胞淋巴瘤可能。细胞淋巴瘤可能。追溯病史：患者有发热、盗汗。追溯病史：患者有发热、盗汗。查体：慢性病容，双侧颈部、腋下及腹股沟查体：慢性病容，双侧颈部、腋下及腹股沟可扪及多个肿大淋巴结，可扪及多个肿大淋巴结，0.5cm2cm大小大小不等，质地中等，活动尚可，无触痛。双眼不等，质地中等，活动尚可，无触痛。双眼内皉可见脓点，耳、鼻、口腔无异常分泌物，内皉可见脓点，耳、鼻、口腔无异常分泌物，鼻窦区无压痛，心肺正常，腹软，肝肋下未鼻窦区无压痛，心肺正常，腹软，肝肋下未及，脾大约肋下两指。及，脾大约肋下两指。一般实验
12、室检查：血常规示：一般实验室检查：血常规示：WBC 36.2x10WBC 36.2x109 9/L/L，LymLym 78%,78%,HbHb 78g/L 78g/L,PltPlt 120 x10 120 x109 9/L/L,肝功能：肝功能：ALB ALB 23.9g/L,23.9g/L,GLB 74g/LGLB 74g/L,ALT,AST,ALT,AST及肾功能正常。及肾功能正常。ESR:142mm/LESR:142mm/L，IgGIgG 57.41g/L 57.41g/L,IgAIgA 7.52g/L 7.52g/L,IgMIgM 1.91g/L1.91g/L。2-MG 14.8mg/L
13、2-MG 14.8mg/L,LDH,LDH 正常，尿正常，尿251mg/L,251mg/L,尿尿95.4mg/L,95.4mg/L,血血13.5g/L,13.5g/L,血血6.72g/L6.72g/L。胸片胸片 右下肺斑片状密度增高影，右膈面局右下肺斑片状密度增高影，右膈面局限性膨升，脊柱侧弯。限性膨升，脊柱侧弯。副鼻窦副鼻窦CT示：双侧上颌窦、筛窦、蝶窦、示：双侧上颌窦、筛窦、蝶窦、额窦腔内可见软组织密度填充影，部分骨额窦腔内可见软组织密度填充影，部分骨壁骨质增生硬化。壁骨质增生硬化。n外周血涂片外周血涂片：成熟粒细胞占：成熟粒细胞占5%，成熟淋巴细胞，成熟淋巴细胞占占95%，但淋巴细胞表面
14、可见明显绒毛样突起，但淋巴细胞表面可见明显绒毛样突起，血小板少。血小板少。n骨髓细胞免疫分型与外周血免疫分型一致。骨髓细胞免疫分型与外周血免疫分型一致。骨髓骨髓n骨髓细胞学：骨髓细胞学：骨髓有核细胞增生活跃，以成熟淋骨髓有核细胞增生活跃，以成熟淋巴细胞为主，占巴细胞为主，占89%，部分细胞可见绒毛样突起。，部分细胞可见绒毛样突起。红、粒、巨核系相对受抑。红、粒、巨核系相对受抑。nCD20+TCL is rare,and clinically and pathologically heterogeneous.When CD20 expression is present in TCL,it ma
15、y be dimmer than that of normal B cells,suggesting neoplastic transformation of a normal CD20dim+T-cell subset.Cases of CD20+TCL in which the proportion of CD20+cells changes over time may reflect aberrant expression of CD20,possibly as an activation marker,by neoplastic T cells.CD20+TCL may cause d
16、iagnostic difficulty,particularly in cases that clinically and pathologically mimic BCL.Knowledge of the unusual phenomenonof CD20 expression in TCL,in conjunction with careful morphologic analysis,the use of a panel of antibodies,and molecular genetic studies,is important in avoiding a isdiagnosis
17、of BCL.骨髓病理提示淋巴细胞极度增生，以成熟阶段为骨髓病理提示淋巴细胞极度增生，以成熟阶段为主，少见原幼淋。淋巴细胞增生性疾病。主，少见原幼淋。淋巴细胞增生性疾病。骨髓病理活检（HE染色）左腋下淋巴结免疫分型左腋下淋巴结免疫分型淋巴结淋巴结n左腋下淋巴活检：外周左腋下淋巴活检：外周T细胞淋巴瘤，非特指型。细胞淋巴瘤，非特指型。淋巴结淋巴结骨髓骨髓外周血外周血CD20CD4/CD8外周外周T细胞淋巴瘤（伴细胞淋巴瘤（伴CD20+），非特指型，），非特指型，B。n予以予以CHOP+E（CTX 0.8 d1,表阿霉素表阿霉素60mg d1,VDS 3mg d1,DXM 20mg d1-5,VP
18、-16 0.15x2d）方案化疗后，病情）方案化疗后，病情明显好转出院。明显好转出院。n正常浆细胞：正常浆细胞：CD138+,CD38+,CD79a+,CD27+,CIg+,CD138+,CD38+,CD79a+,CD27+,CIg+,SIgSIg-,CD19(75%+),CD45+,CD56,CD20,CD28,-,CD19(75%+),CD45+,CD56,CD20,CD28,CD33,CD117,CD33,CD117,胞浆胞浆/正常正常nMMMM细胞细胞:CD138+,CD38+,CD79a+,CD27(40-50%+),:CD138+,CD38+,CD79a+,CD27(40-50%+
19、),CIgCIg+,+,SIgSIg-,CD56(75%+),CD117(30%+),CD20(30%+),-,CD56(75%+),CD117(30%+),CD20(30%+),CD10-/+,CD19,CD10-/+,CD19,胞浆胞浆/异常异常n联合联合CD38/CD56/CD19/CD45CD38/CD56/CD19/CD45能鉴别出能鉴别出9090以上以上MMMM的瘤的瘤细胞和正常浆细胞细胞和正常浆细胞MMMM诊断诊断免疫表型及免疫表型及轻链限制性表达轻链限制性表达侧向散射侧向散射前向散射前向散射细胞内细胞内LambdaCD38CD19CD45CD20CD10CD56kappaInt
20、racellular KappaIambda急性白血病的微小残留病检测急性白血病的微小残留病检测 MRD是指在白血病患者完全缓解后，体内残存少是指在白血病患者完全缓解后，体内残存少量白血病细胞的状态量白血病细胞的状态 MRD检测对于评估疾病状态、判断疗效、预测复检测对于评估疾病状态、判断疗效、预测复发、早期干预具有重要临床意义发、早期干预具有重要临床意义 多参数流式细胞仪和荧光定量多参数流式细胞仪和荧光定量PCR技术的发展显技术的发展显著提高了著提高了MRD检测的敏感性和准确性检测的敏感性和准确性敏感性低敏感性低v白血病细胞可出现异常的免疫表型以及细胞散射光特征的改变vFCM检测MRD的原理是
21、对散射光异常或“白血病相关”表型进行检测，可同时定量测定多个参数变化vFCM检测MRD的敏感性约在10-310-4v适用范围广、操作快捷v尚未发现真正意义上的白血病细胞特异性抗原患者，女，患者，女，66岁，岁，AML-M12012.3.确诊为确诊为AML-M1，半年后复查，半年后复查MRD，标本：，标本：BMMRD(-)杨玉槐杨玉槐-AML-M2-CR-AML-M2-CR后脑脊液后脑脊液-20140409-20140409流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=免疫功能研究免疫功能研究=各种干细胞的检测各种干细胞的检测=癌症病人的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞功能及代谢动力学研究细胞功能及代谢动力学研究=血小板分析（心血管疾病）血小板分析（心血管疾病）=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究 FCM 进进 展展1 1 从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对细胞计数到绝对细胞计数2 2 从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析3 3 从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析4 4 从细胞膜成份到细胞内成份分析从细胞膜成份到细胞内成份分析5 5 从有形成分到可溶性成分的分析从有形成分到可溶性成分的分析6 6 从悬液到切片。从悬液到切片。64Thank you!
