1、肺炎支原体肺炎支原体明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验及其临床应用及其临床应用肺炎支原体（肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是引起）是引起非典型性肺炎的常见病原体。支原体肺炎的发病率可非典型性肺炎的常见病原体。支原体肺炎的发病率可占到所有肺炎病例的占到所有肺炎病例的2030%Mp主要的易感对象为儿童和年轻人，但近年来发现主要的易感对象为儿童和年轻人，但近年来发现65岁以上老年人群发生的社区获得性肺炎中有岁以上老年人群发生的社区获得性肺炎中有15%是是Mp引起的，且引起的，且5岁以下的婴幼儿也可发生感染岁以下的婴幼儿也可发生感染Mp感染可发生在一年中的任何季节，没有明显
2、的季节感染可发生在一年中的任何季节，没有明显的季节流行特征。支原体肺炎同时具有地方性和周期流行性流行特征。支原体肺炎同时具有地方性和周期流行性的特点，流行周期一般为的特点，流行周期一般为37年，在流行的高峰时，其年，在流行的高峰时，其发病率可达到肺炎总发病率的发病率可达到肺炎总发病率的7080%Mp感染临床上主要表现为气管炎和上呼吸道感染症状。感染临床上主要表现为气管炎和上呼吸道感染症状。约约15%的感染者没有临床症状，只有的感染者没有临床症状，只有510%会发展成会发展成为肺炎。其主要特点是起病较慢，有头疼、发热、咽为肺炎。其主要特点是起病较慢，有头疼、发热、咽喉疼痛、不适以及最典型的干咳等
3、症状。一般情况下，喉疼痛、不适以及最典型的干咳等症状。一般情况下，支原体肺炎的死亡率不高，但少见的肺外感染（累及支原体肺炎的死亡率不高，但少见的肺外感染（累及神经、心脏、关节、红细胞等）却往往表现出更严重神经、心脏、关节、红细胞等）却往往表现出更严重的症状的症状肺炎支原体概况肺炎支原体概况 可引起非典型肺炎的病原体很多，单凭临床症状和影象可引起非典型肺炎的病原体很多，单凭临床症状和影象学检查不能明确区分学检查不能明确区分Mp和其它病原体所引起的感染，因此和其它病原体所引起的感染，因此实验室检测结果就显得尤为重要：实验室检测结果就显得尤为重要：一般实验检查一般实验检查 白细胞计数白细胞计数(25
4、%升高升高)；血沉；血沉(30%升高升高)；痰液检查；痰液检查(无革兰阴性菌无革兰阴性菌)；肝肾功能；肝肾功能(可能出现一些非特异性的异常可能出现一些非特异性的异常)培养培养 根据临床上的情况，咽拭子、痰液、胸水、肺活检组织根据临床上的情况，咽拭子、痰液、胸水、肺活检组织等均可用于培养。应注意床边接种及使用运送培养基（等均可用于培养。应注意床边接种及使用运送培养基（SP4肉汤）。培养需要营养要求很高的专用选择性培养基，耗时肉汤）。培养需要营养要求很高的专用选择性培养基，耗时长长(35周周)且敏感性一般且敏感性一般血清学试验血清学试验 是目前实验室检测的主要方法是目前实验室检测的主要方法抗原检测
5、抗原检测 使用抗原捕获酶免疫测定使用抗原捕获酶免疫测定,据称可达到较高的敏感性和据称可达到较高的敏感性和特异性。但该方法有被分子生物学方法取代的趋势特异性。但该方法有被分子生物学方法取代的趋势分子生物学检测分子生物学检测 近年来各种分子杂交和近年来各种分子杂交和PCR检测方法在科研中的应用越检测方法在科研中的应用越来越多，今后有可能成为来越多，今后有可能成为Mp实验室诊断的常规方法之一实验室诊断的常规方法之一肺炎支原体的实验室检测肺炎支原体的实验室检测人类对人类对Mp无先天免疫性，尚无可实际应用的有效疫无先天免疫性，尚无可实际应用的有效疫苗，感染后也不能产生完全的保护性免疫苗，感染后也不能产生
6、完全的保护性免疫Mp特异性的特异性的IgM抗体在发病后不久即可出现升高，抗体在发病后不久即可出现升高，14周内达到峰值，然后在几个月内逐渐下降到没有周内达到峰值，然后在几个月内逐渐下降到没有临床意义的水平。急性感染后临床意义的水平。急性感染后IgM的持续时间在不同的持续时间在不同个体中差异较大。儿童的个体中差异较大。儿童的IgM反应一般强于成人，约反应一般强于成人，约50%的成人患者无法在的成人患者无法在Mp感染后测到感染后测到IgM的升高的升高IgG的出现时间晚于的出现时间晚于IgM，5周左右达到峰值，上升周左右达到峰值，上升速度较慢且在体内的持续时间较长（速度较慢且在体内的持续时间较长（4
7、年左右），但年左右），但在感染数月后就会下降到较低水平。有些儿童无法在感染数月后就会下降到较低水平。有些儿童无法测得明显的测得明显的IgG反应反应特异性特异性IgA的免疫反应与的免疫反应与IgM类似，但其在成年人尤类似，但其在成年人尤其是老年人中的反应水平更高其是老年人中的反应水平更高肺炎支原体的免疫性肺炎支原体的免疫性冷凝集试验冷凝集试验：冷凝集素是对：冷凝集素是对Mp最早的体液反应，最早的体液反应，50%的病人在的病人在Mp感染第感染第2周时的滴度可达到周时的滴度可达到1:32以上，而以上，而6周内即降至感染前的水平。冷凝集试验虽然简便、快周内即降至感染前的水平。冷凝集试验虽然简便、快速，
8、但它不是针对速，但它不是针对Mp的特异性试验，多种其他微生物的特异性试验，多种其他微生物感染（如感染（如EB病毒、巨细胞病毒、肺炎克雷伯菌）和自病毒、巨细胞病毒、肺炎克雷伯菌）和自身免疫性疾病时冷凝集素滴度均可升高。同时，该试身免疫性疾病时冷凝集素滴度均可升高。同时，该试验的敏感性也只有验的敏感性也只有5060%，对于，对于12岁以下的儿童其敏岁以下的儿童其敏感性则更差感性则更差补体结合试验补体结合试验(CFT)：十几年前，：十几年前，CFT仍是仍是Mp血清学血清学试验的标准方法，但越来越多的研究表明该方法的敏试验的标准方法，但越来越多的研究表明该方法的敏感性和特异性都不够高。感性和特异性都不
9、够高。CFT所用的抗原为所用的抗原为Mp的氯仿的氯仿-甲醇糖脂抽提物，它可与人类、细菌及植物的某些抗甲醇糖脂抽提物，它可与人类、细菌及植物的某些抗原表位发生交叉反应（如脑膜炎时，原表位发生交叉反应（如脑膜炎时，CFT滴度可明显滴度可明显升高）。升高）。CFT测定的主要是测定的主要是IgM，对，对IgG不很敏感，导不很敏感，导致其整体敏感性偏低。致其整体敏感性偏低。肺炎支原体的血清学试验（一）肺炎支原体的血清学试验（一）间接血凝试验间接血凝试验(PHA)：将提纯的将提纯的Mp抗原连接到红细胞抗原连接到红细胞（禽类或羊）上，与血清中的抗（禽类或羊）上，与血清中的抗Mp抗体可发生凝集反抗体可发生凝集
10、反应。该试验的敏感性和特异性均明显优于应。该试验的敏感性和特异性均明显优于CFT。PHA不不能区分抗体的类型，因此单份测定出现低滴度的抗体阳能区分抗体的类型，因此单份测定出现低滴度的抗体阳性结果并不能确定是既往感染还是新近感染。最好能间性结果并不能确定是既往感染还是新近感染。最好能间隔隔23周再采取第周再采取第2份血样进行测定，观察抗体滴度是否份血样进行测定，观察抗体滴度是否有有4倍以上的增加（血清转化）。单次测定出现高滴度倍以上的增加（血清转化）。单次测定出现高滴度抗体阳性（大于抗体阳性（大于1:8）也有助于对）也有助于对Mp新近感染的判断新近感染的判断明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA
11、)：其原理与间接血凝试验基本相其原理与间接血凝试验基本相同，只是用人工合成的明胶颗粒取代了红细胞作为凝集同，只是用人工合成的明胶颗粒取代了红细胞作为凝集试验的载体，从而使结果判定更清晰，静置稳定性更好，试验的载体，从而使结果判定更清晰，静置稳定性更好，非特异性反应大大减少，检测的敏感性也有了进一步提非特异性反应大大减少，检测的敏感性也有了进一步提高（对高（对IgM和和IgA更敏感）更敏感）肺炎支原体的血清学试验（二）肺炎支原体的血清学试验（二）酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）：）：是目前是目前Mp血清学试验血清学试验中常用的方法，可分开检测中常用的方法，可分开检测IgM、IgG
12、和和IgA，敏感性和，敏感性和特异性均能达到较高的水平。虽然单次测定特异性均能达到较高的水平。虽然单次测定IgM（或（或IgA）阳性即可基本判定为）阳性即可基本判定为Mp的新近感染，但阴性时却的新近感染，但阴性时却无法排除感染的可能性。无法排除感染的可能性。IgG一般须进行间隔一般须进行间隔2周以上的周以上的双份血清测定，有双份血清测定，有4倍以上滴度上升时才能做出倍以上滴度上升时才能做出Mp新近新近感染的诊断。因此，在感染的诊断。因此，在ELISA测定中应强调同时检测测定中应强调同时检测IgG和和IgM（或（或IgA），且最好能对间隔），且最好能对间隔2周以上的双份周以上的双份配对血清进行抗
13、体转化情况的测定，从而做出明确的诊配对血清进行抗体转化情况的测定，从而做出明确的诊断断金标快速检测：金标快速检测：具有简便、快速的优点。但也同样应强具有简便、快速的优点。但也同样应强调调IgG和和IgM的同时检测。由于只能进行定性测定，无的同时检测。由于只能进行定性测定，无法观察血清转化情况，限制了其在临床诊断中的价值法观察血清转化情况，限制了其在临床诊断中的价值其它方法：其它方法：间接免疫荧光试验（间接免疫荧光试验（IFA）、乳胶凝集试验）、乳胶凝集试验（LA）、免疫印迹测定（）、免疫印迹测定（WB）、黏附抑制试验、放射）、黏附抑制试验、放射免疫沉淀试验、补体介导的杀伤试验等免疫沉淀试验、补
14、体介导的杀伤试验等肺炎支原体的血清学试验（三）肺炎支原体的血清学试验（三）对肺炎支原体的治疗原则对肺炎支原体的治疗原则对仅有上呼吸道症状的肺炎支原体感染，不需要进行对仅有上呼吸道症状的肺炎支原体感染，不需要进行抗生素治疗抗生素治疗支原体肺炎虽然有一定的自限性，但仍应进行抗生素支原体肺炎虽然有一定的自限性，但仍应进行抗生素治疗以缩短病程并减少其传染性治疗以缩短病程并减少其传染性在非典型性肺炎的病原体未完全确定时，可以采取一在非典型性肺炎的病原体未完全确定时，可以采取一些经验用药，对些经验用药，对Mp有效的药物也能覆盖一些其他病有效的药物也能覆盖一些其他病原体（非病毒类）原体（非病毒类）抗生素的使
15、用：首选为大环内酯类，也可选用四环素抗生素的使用：首选为大环内酯类，也可选用四环素类（老年人）和喹诺酮类。类（老年人）和喹诺酮类。Mp对对-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素天然耐药，磺胺类对天然耐药，磺胺类对Mp也没有作用也没有作用抗生素使用一般应持续抗生素使用一般应持续710天，但口服用药延长至天，但口服用药延长至1421天也是合适的天也是合适的除使用抗生素外，还应采取一些对症治疗措施（止咳除使用抗生素外，还应采取一些对症治疗措施（止咳药、退烧药、止痛剂等）药、退烧药、止痛剂等）赛乐迪亚（赛乐迪亚（Serodia）MYCOII 肺炎支原体抗体明胶颗粒凝集试验肺炎支原体抗体明胶颗粒凝集试验凝集试验
16、与凝集试验与ELISA的原理比较（一）的原理比较（一）ELISA Color凝集试验凝集试验凝集试验与凝集试验与ELISA的原理比较（二）的原理比较（二）ELISA凝集试验凝集试验凝集试验与凝集试验与ELISA操作步骤的比较操作步骤的比较ELISA凝集试验凝集试验加入样品和稀释液加入样品和稀释液第一步反应第一步反应洗涤洗涤洗涤洗涤第二步：第二步：酶反应酶反应显色显色第三步：第三步：加入底物加入底物结果判读结果判读孵孵 育育凝集图像凝集图像反应温度对凝集试验及反应温度对凝集试验及ELISA的影响的影响凝集试验凝集试验 10 20 30反应温度（反应温度（）反应反应ELISA 不同类型样品对不同类
17、型样品对凝集试验及凝集试验及ELISA检测结果的影响检测结果的影响 X：假阳性：假阳性 O加热灭活加热灭活 X：与底物有关：与底物有关O溶血溶血O黄疸黄疸 O脂血脂血 OO血浆血浆 O O血清血清 ELISA 凝集试验凝集试验样品类型样品类型O：无影响：无影响：部分有影响：部分有影响X：有影响：有影响明胶颗粒的制备明胶颗粒的制备明明 胶胶阿拉伯胶阿拉伯胶醋醋 酸酸染料染料/色素色素偏偏 磷磷 酸酸乙乙 醇醇水水 3.0m表面电荷表面电荷-0.760 -0.830 明胶颗粒（电镜照片）明胶颗粒（电镜照片）明胶颗粒的致敏明胶颗粒的致敏 5%明胶颗粒明胶颗粒/0.15M PBS（pH7.2）5ppm
18、 丹宁酸丹宁酸/0.15M PBS（pH7.2）孵育（孵育（37，15min）生理盐水洗涤（生理盐水洗涤（2000rpm，5min）活化的明胶颗粒活化的明胶颗粒/0.15M PBS（pH59）抗原抗原孵育（孵育（37，60min）生理盐水洗涤（生理盐水洗涤（2000rpm，5min）5%致敏明胶颗粒致敏明胶颗粒/悬浮液悬浮液*冷冻干燥冷冻干燥*0.15M PBS（加入正常兔血清、明胶、阿拉伯胶等）（加入正常兔血清、明胶、阿拉伯胶等）SERODIA-MYCOII操作步骤操作步骤SERODIA-MYCOII的结果判读的结果判读最终稀释倍数最终稀释倍数非特异性反应非特异性反应滴度滴度40801603
19、206401280256051201024020480对对照照肺炎支原体肺炎支原体（Mac株）株）+640人形支原体人形支原体（PG21株）株）40唾液支原体唾液支原体 40口腔支原体口腔支原体 40口腔支原体口腔支原体II型型 40发酵支原体发酵支原体 40咽支原体咽支原体 40SERODIA-MYCOII的特异性的特异性正常人肺炎支原体抗体滴度的分布正常人肺炎支原体抗体滴度的分布Myco II测定的抗体滴度达到测定的抗体滴度达到1:40：抗：抗Mp抗体阳性抗体阳性Myco II测定的抗体滴度达到测定的抗体滴度达到1:160：提示新近感染：提示新近感染以以p180免疫印迹法作为参考方法，用免
20、疫印迹法作为参考方法，用56份血清样品对份血清样品对5种种Mp抗体商品化试验进行评抗体商品化试验进行评估估p180/其它方法其它方法血清份数血清份数CFTIFAELISAPALA333333333321201922210000023412总体一致率总体一致率 96.4%94.6%92.8%98.2%96.4%敏感性敏感性 100%100%100%100%100%特异性特异性 91.3%87.0%82.6%95.6%91.3%CFT：补体结合试验；：补体结合试验；IFA：间接免疫荧光试验；：间接免疫荧光试验；ELISA：酶联免疫吸附试验；：酶联免疫吸附试验；PA：明胶颗粒凝集试验；：明胶颗粒凝集
21、试验；LA：乳胶凝集试验：乳胶凝集试验SERODIA-MYCOII与其它方法比较（一）与其它方法比较（一）p180免疫印迹图象出现显著变化的免疫印迹图象出现显著变化的6对血清样品的血清检测结果对血清样品的血清检测结果患者号患者号(性性别别/年龄年龄)日期日期月月/日日p180印迹印迹CFTIFAELISAPALAO.D.值值比率比率1(男男/3岁岁)1/081/250+832641280.010.27274012802(男男/4岁岁)10/1612/170+832645120.210.412405120+3(男男/4岁岁)1/162/170+2560.340.872.53202560+4(男男
22、/19岁岁)10/1611/030+10240.310.31140204805(男男/12岁岁)3/193/31+8646410240.390.942.440204806(女女/26岁岁)1/061/19+864642560.270.481.86401280+CFT：补体结合试验；：补体结合试验；IFA：间接免疫荧光试验；：间接免疫荧光试验；ELISA：酶联免疫吸附试验；：酶联免疫吸附试验；PA：明胶颗粒凝集试验；：明胶颗粒凝集试验；LA：乳胶凝集试验：乳胶凝集试验SERODIA-MYCOII与其它方法比较（二与其它方法比较（二）0.00%0.00%10.00%10.00%20.00%20.0
23、0%30.00%30.00%40.00%40.00%50.00%50.00%60.00%60.00%1月1月3月3月5月5月7月7月9月9月11月11月某市某市2003年就诊患者年就诊患者Mp抗体检测阳性率月份分布抗体检测阳性率月份分布全年平均阳性率为：全年平均阳性率为：40.1%（5254/13094）SERODIA-MYCOII临床应用（一）临床应用（一）诊断标准诊断标准大于等于大于等于 1:160小于小于1:160 总计总计 检测阳性数检测阳性数 112 171 283 出院确诊数出院确诊数 101 132 233 诊断符合率诊断符合率 90.18%77.19%82.3%2004年年1-
24、3月某医院病房送检月某医院病房送检Mp结果与临床诊断符合率结果与临床诊断符合率说明：在说明：在283例例 M p阳性病例中，有阳性病例中，有50例的出院第一诊例的出院第一诊断为非断为非Mp感染疾病，不排除同时有感染疾病，不排除同时有MP感染的可能。感染的可能。SERODIA-MYCOII临床应用（二）临床应用（二）SERODIA-MYCOII临床应用结论临床应用结论SERODIA-MYCOII凝集试验定量检测的是肺炎支原凝集试验定量检测的是肺炎支原体特异性抗体含量，包括体特异性抗体含量，包括IgG和和IgM抗体。抗体。在诊断方面，由于有部分患者、特别是约在诊断方面，由于有部分患者、特别是约50
25、%的成人的成人患者无法在患者无法在Mp感染后测到感染后测到IgM的升高；的升高；而而Mp IgG抗抗体在感染数月后仍会下降到较低水平。体在感染数月后仍会下降到较低水平。IgG和和IgM抗抗体滴度达到一定高度时，表现出较好的临床诊断价值。体滴度达到一定高度时，表现出较好的临床诊断价值。在具有发热、咳嗽等症状的上感及非典型肺炎患者中，在具有发热、咳嗽等症状的上感及非典型肺炎患者中，Mp具有较高的感染率，具有较高的感染率，Mp感染的实验室诊断在临床感染的实验室诊断在临床具有广泛的应用价值。具有广泛的应用价值。SERODIA-MYCOII检测阳性结果对临床检测阳性结果对临床Mp感染的感染的诊断与治疗具有令人满意的指导意义。诊断与治疗具有令人满意的指导意义。谢谢 谢！谢！
